SPREADING OF TISSUE SPHEROIDS FROM PRIMARY HUMAN FIBROBLASTS ON THE SURFACE OF MICROFIBROUS ELECTROSPUN POLYURETHANE MATRIX (A scanning electron microscopic study)

Full Text

Трехмерную биопечать органов можно опре-Технология электроспиннинга позволяет делить как автоматизированную послойную био-создавать биосовместимые микроволокнистые фабрикацию функциональных трехмерных тка-матриксы, которые очень напоминают по своей невых и органных конструкций на основе цифро-структурной организации внеклеточный матрикс. вой модели с использованием тканевых сферои-Электроспиннинг - это технология производства дов в качестве строительных блоков [8]. Тканевые тонких филаментов из раствора биополимера сфероиды - это трехмерные агрегаты плотно под воздействием электрического заряда [8, 11]. расположенных культуральных клеток различ-Показано, что тканевые сфероиды прикрепного происхождения. Фундаментальным биологи-ляются к электроспиннинговым синтетическим ческим принципом данного варианта технологии матриксам [2], которые могут удерживать тканебиопечати является феномен тканевого слияния вые сфероиды в прикрепленном [15] или распла[10]. Предполагается, что тканевые сфероиды, станном состоянии [1]. При этом прикрепленные находящиеся близко друг к другу, сливаются в к электроспинниговому микроволокнистому синрезультате действия сил поверхностного натяже-тетическому матриксу тканевые сфероиды могут ния [3], однако это происходит только в том слу-сливаться [1], однако кинетике их распластывания чае, если они удерживаются в непосредственном и вопросам биосовместимости не уделено достаконтакте друг с другом. Для удержания тканевых точного внимания. Теория распластывания клеток сфероидов рядом друг с другом в трехмерном про-на матриксах была описана ранее [12]. странстве предложено использовать напечатан-Цель настоящего исследования - изучение ные синтетические каркасы [4, 13], гидрогели [5] распластывания тканевых сфероидов на поверхи даже металлические стержни [9]. ности электроcпиннингового микроволокнистого полиуретанового матрикса и его биосовместимости. Материал и методы. Биосовместимый полиуретан (EG-85A, Lubrizol, США), разрешенный для клинического использования в США, был любезно предоставлен проф. Сюдженом Веном (Xuejun Wen, США). Микроволокнистый полиуретановый матрикс был получен методом электроспиннинга (Yflow, Испания). Тканевые сфероиды получали из первичной культуры фибробластов человека с использованием неадгезивных агарозных форм. Первичные фибробласты человека (Lonza, Германия, кат.# CC-2511) культивировали при температуре 37 ºС во влажной атмосфере с 5% CO2 в среде DMEM (Gibco, Германия, кат.# 12491-015), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, Германия, кат.# 16000-044), 1 мМ L-глутамин (Панэко, Россия, кат.# Ф032) и смесь антибиотиков/антимикотиков (Gibco, Германия, кат.# 15240-062). Формирование тканевых сфероидов проводили с помощью неадгезивных агарозных форм. Агарозные формы на основе силиконовых штампов (Microtissues, США, кат.# 12-81), содержащие 81 ячейку, были получены из 2% раствора агарозы в натрий-фосфатном буфере. Из первичной культуры фибробластов человека была приготовлена клеточная суспензия с концентрацией 6,8·106 кл/мл. В каждую из агарозных форм было помещено по 190 мкл клеточной суспензии. Через 40 мин, когда клетки полностью осели на дно ячеек, вокруг агарозных форм была добавлена культуральная среда. Агарозные формы, содержащие формирующиеся сфероиды, инкубировали при температуре 37 ºС во влажной атмосфере с 5% CO2 в течение 3 сут. Полученные 3-суточные тканевые сфероиды размещали на поверхности электроспиннингового полиуретанового матрикса с помощью оригинального трехмерного мультифункционального биопринтера Фабион (3Д Биопринтинг Солюшенс, Россия). Для сканирующей электронной микроскопии образцы подвергали дегидратации, высушиванию методом перехода критической точки на установке HCP-2 (Hitachi, Япония) и напылению золотом с помощью установки ионного напыления IB-3 (EIKO, Япония). Напыленные образцы изучали, используя сканирующий электронный микроскоп JSM -6510 LV (JEOL, Япония). Кинетику распластывания тканевых сфероидов на электроспиннинговом полиуретановом матриксе оценивали путем измерения их диаметра в ходе прикрепления и последующего распластывания. Проведено 2 эксперимента, в каждом из них были использованы следующие временные точки распластывания: 4, 24, 48 ч, 4 и 7 сут. В каждой временной точке были измерены 15-20 сфероидов. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы GraphPad Prizm (Ла Хойя, США). Результаты исследования. При сканирующей электронной микроскопии было обнаружено, что электроспиннинговые полиуретановые волокна имеют регулярный диаметр (рис. 1), сливаются в точках их пересечения (см. рис. 1, б), образуя однородную плотную сеть филаментов. Морфометрический анализ полученных изображений показал, что диаметр волокон составляет 3,2±1,4 мкм. Тканевые сфероиды (рис. 2) были регулярно размещены на поверхности электроспиннингового микроволокнистого полиуретанового матрикса с помощью оригинального трехмерного биопринтера Фабион (рис. 3). На начальной стадии распластывания, занимающей от 1 до 4 ч, от внешней поверхности сфероидов начинают отделяться клетки-пионеры, прикрепляющиеся ведущим краем к поверхности матрикса. При этом тело клеток остается в составе сфероида. Диаметр сфероидов на этой стадии не претерпевает существенных изменений и составляет 281±14 мкм. На следующей стадии распластывания, на 1-е и 2-е сутки, отдельные клетки покидают тело сфероидов и мигрируют по волокнам матрикса (рис. 4, а, б). Диаметр тела сфероидов остается неизменным - 283±13 мкм. Однако, если учитывать клетки, мигрирующие на матрикс, диаметр сфероидов увеличивается до 558±99 мкм. На 4-е сутки существенно возрастает количество мигрирующих из сфероида клеток, их можно выделить в отдельную зону (см. рис. 4, в). Общий диаметр сфероидов с учетом распластанных клеток составляет 984±41 мкм. Тело сфероида существенно уплощается, однако по-прежнему остается видимым. На 7-е сутки сфероид практически дезинтегрирован (см. рис. 4, г), и на поверхности матрикса визуализируются многочисленные фибробласты, ориентированные вдоль волокон матрикса. От тела сфероида остается уплощенный купол, по диаметру совпадающий с исходным сфероидом - 312±56 мкм. Общий диаметр сфероидов с учетом зоны мигрировавших клеток составляет 2718±126 мкм. Таким образом, измерение диаметров тканевых сфероидов показало, что они довольно быстро прикрепляются к поверхности полиуретанового матрикса и в течение нескольких суток полностью распластываются, что свидетельствует о высокой биосовместимости сфероидов с полиуретановым матриксом. В ходе распластывания первичные фибробласты человека используют отростки ведущего края клетки (ламеллоподии и филоподии) для начального контакта с волокнами матрикса (рис. 5). Обсуждение полученных данных. Согласно полученным данным, при полном распластывании диаметр дезинтегрированного тканевого сфероида превышает его изначальный диаметр в 8,4 раза. Распластывание тканевого сфероида является результатом баланса физических сил, оперирующих на границе клеток и матрикса и между самими клетками внутри тканевого сфероида. Если клеточно-матриксовые взаимодействия (адгезия к матриксу) намного сильнее, чем клеточно-клеточные взаимодействия (когезия), то результатом является наблюдаемое полное распластывание до уровня клеточного монослоя [12]. С другой стороны - слабые физические силы взаимодействия между клетками и матриксом (слабая адгезия) и сильные клеточно-клеточные взаимодействия между клетками внутри сфероида (сильная когезия) могут привести к образованию так называемых прикрепленных, но нераспластанных тканевых сфероидов [15]. Кинетику распластывания тканевых сфероидов можно использовать в качестве количественного показателя для оценки тканевой биосовместимости новых электроспиннинговых биоматериалов. Зона контакта ведущего края фибробластов с филаментами полиуретанового матрикса нуждается в дальнейшем систематическом исследовании с применением современных методов нанотомографии. Недавно было показано, что электроспиннинговый синтетический матрикс можно магнитно функционализировать с помощью магнитных наночастиц [6]. Магнитная функционализация - это добавление магнитных наночастиц в биополимер, после чего он приобретает магнитные свойства. Более того, тканевые сфероиды также могут быть сформированы из клеток, предварительно меченных магнитными наночастицами [14]. Это позволяет начать разработку принципиально новых технологий трехмерной магнитной биопечати, основанной на магнитной левитации (перемещении объектов в трехмерном пространстве под влиянием магнитных сил) с использованием в качестве носителя для тканевых сфероидов биосовместимого микроволокнистого электроспиннингового полиуретанового матрикса. Тканевые сфероиды, сформированные из первичных фибробластов человека, были регулярно расположены с помощью биопринтера на поверхности микроволокнистого матрикса, созданного методом электроспиннинга. Они могут прикрепляться и распластываться на электроспиннинговом полиуретановом матриксе, что свидетельствует о его высокой биосовместимости. Процесс прикрепления тканевых сфероидов осуществляется в течение нескольких часов, полное распластывание происходит в течение 7 сут Тканевые конструкции, образующиеся в результате прикрепления и распластывания тканевых сфероидов на электроспиннированных матриксах, могут служить новой технологической платформой в трехмерной биопечати. Авторы благодарят за предоставленную возможность выполнить исследования на сканирующем электронном микроскопе в Центре коллективного пользования электронной микроскопии Института биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН.

About the authors

Ye. V. Kudan

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

F. D. A. S. Pereira

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

V. A Parfenov

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

V. A Kasyanov

P. Stradina Riga University; Riga Technical University

Email: kasyanov@latnet.lv
Laboratory of Biomechanics

Yu. D. Khesuani

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

Ye. A. Bulanova

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

A. Aleksandrovich Mironov

3D Bioprinting Solutions

Laboratory of Biotechnological Research

References

Supplementary files