SYNAPTOGENESIS IN THE DORSAL RAPHE NUCLEUS OF RAT MEDULLA OBLONGATA IN SEROTONIN DEFICIENCY

Full Text

Взаимоотношения между нейронами в ЦНС осуществляются в большей мере посредством специализированных синаптических контактов, которые формируются в раннем периоде онтогенеза с участием определенных зон одного или двух нейронов (компонентов пре-и постсинаптической мембраны) на уровне их тел и отростков. Способность к образованию синапсов максимально реализуется в развивающемся мозгу, при этом от своевременного установления высокоспецифических контактов между многообразными нейронами зависит функциональная активность структур мозга [8, 9, 11], а активность мозга, в свою очередь, сопровождается усложнением пространственной организации синапсов и увеличением их эффективности. Показано, что для периода развития различных отделов мозга характерным является как формирование синаптических контактов, так и элиминация последних — лишних, незрелых и неэффективных. При этом отдельные синапсы могут быть устойчивыми в течение продолжительных периодов времени, а другие — сохраняют поразительную способность к быстрой разборке и реорганизации [9–11], обеспечивая, тем самым, синаптическую пластичность. Особого внимания заслуживает исследование процессов синаптогенеза в стволовых ядрах, клетки которых содержат моноамины, в частности, серотонин, поскольку эти клеточные группы представляют собой ключевые источники как эфферентных восходящих, так и нисходящих серотонинергических аксонных систем мозга у млекопитающих [12], оказывающие влияние на развитие и функции других отделов ЦНС [1, 4–7], так и афферентные волокна, обеспечивающих с ними обратную связь. Несмотря на важность проблемы, процесс формирования синапсов в моноаминергических структурах в настоящее время остается практически не изученным. В связи с этим проведено морфологическое исследование, цель которого — изучить динамику изменения синаптогенеза в дорсальном ядре шва (nucleus raphes dorsalis — NRD) в конце пренатального и раннего постнатального периодов развития, а также выявить роль серотонина в формировании синаптических контактов в этот период развития. Материал и методы. Работа выполнена на лабораторных крысах линии Вистар. Были использованы 10 беременных самок, из них: 6 экспериментальных и 4 контрольных (интактных). Все экспериментальные процедуры осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Для снижения содержания серотонина в мозгу плодов использовали метод ингибирования ключевого фермента его синтеза — триптофангидроксилазы пара-хлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА крысам вводили однократно, внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг на 16-е сутки беременности в период формирования у плодов NRD, вызывая дефицит серотонина и, как следствие, нарушая его развитие [1]. Доза была выбрана с учетом данных литературы, свидетельствующих о снижении содержания серотонина до 50–80% у взрослых животных и плодов [2, 10, 12]. Исследование головного мозга у плодов проводили в конце пренатального (на 19-еи 20-е сутки) и у животных раннего постнатального (на 5-еи 20-е сутки) периодов развития. В качестве контроля использовали головной мозг крысят соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок. Гистологическому анализу подвергали мозг, взятый от 8–10 плодов и крысят каждого срока развития. Детально исследовали состояние разных частей NRD: дорсальной (NRD-d), вентральной (NRD-v) и латеральных (NRD-l). У контрольных животных и у развивавшихся при дефиците серотонина идентификацию структур мозга проводили по атласу [13]. Мозг крысят фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) в течение 24 ч, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике, готовили серийные фронтальные срезы толщиной 5–7 мкм. Для обнаружения синаптофизин-позитивных структур использовали кроличьи поликлональные антитела к синаптофизину (интегральному мембранному гликопротеину) — маркеру пресинаптических пузырьков (DakoCytomation, Дания) в разведении 1:1. Для выявления комплекса антиген—антитело применяли набор реагентов LSAB+2 (Dako, Дания). Визуализацию продукта реакции проводили при помощи хромогена DAB+ (Dako, Дания). Для оценки плотности продукта реакции использовали полуколичественный метод, выражая самую высокую плотность расположения синаптофизин-иммунопозитивных гранул как 5+. Принято считать, что выявляемые синаптофизин-позитивные гранулы идентифицируют пресинаптическую часть синапса и, таким образом, определяют места контактов между нейронами [9, 11]. Условия процедуры иммуноцитохимической реакции (длительность инкубации, температура, концентрация и количество реагентов) стандартизировали, одновременно окрашивали препараты, полученные как от контрольных животных, так и подопытных. После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Джалла (Био Витрум, Россия) и заключали в синтетическую среду Permount (Dako, Дания). Исследования проводили, используя световой микроскоп DME (Leica, Германия), изображения были получены при помощи цифровой видеокамеры (Leica, Германия). Для компьютерной морфометрии использовали поперечные срезы стволовой части мозга. С помощью цифровой камеры, встроенной в микроскоп, получали изображения, на которых при помощи программы ImageJ (США) определяли площади тел нейронов. Измерения проводили на 10 гистологических срезах (каждом 3-м серийном срезе) у всех животных экспериментальной и контрольной групп. Статистическую обработку полученных морфометрических показателей осуществляли при помощи компьютерных программ ImageScope Color и ORIGIN50. Определяли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. У плодов контрольной группы на 19-еи 20-е сутки развития в NRD-d, NRD-v и NRD-l начинает развиваться нейропиль, отдельные нейроны располагаются на расстоянии друг от друга. Наличие на срезах оснований отростков тел клеток дает возможность предположить, что некоторые молодые нейроны уже имеют по 2–3 отростка. Встречаются нейроны, попарно прилежащие друг к другу. В нейропиле отдельные терминальные отростки имеют иммунопозитивную реакцию цитоплазмы на синаптофизин. По ходу отростков на поверхности некоторых из них присутствуют синаптофизинпозитивные гранулы, как мелкие одиночные, так и собранные (по 8–10) в группы, плотность их расположения можно оценить как 1+. В этот срок развития на теле некоторых клеток уже встречаются мелкие одиночные, а иногда довольно крупные синаптофизин-позитивные гранулы. У плодов крыс, развивавшихся при дефиците серотонина, во всех частях NRD на 19-еи 20-е сутки нейропиль менее развит, тела нейральных клеток имеют значимо меньшие размеры, чем в контроле (84±6 и 98±4 мкм2 соответственно) и располагаются близко друг к другу, более того, присутствуют прилежащие друг к другу клетки как парно, так и составляющие группы по 3–5 клеток. В нейропиле цитоплазма многих отростков дает положительную реакцию на синаптофизин. На поверхности отростков определяются одиночные синаптофизин-позитивные гранулы, на поверхности тел нейронов их практически нет (рисунок, а, б). Исследование мозга контрольных животных на 5-е сутки постнатального развития показало, что нейропиль уже хорошо развит, ив NRD-d, NRD-v и NRD-l одинаково высокая плотность синаптофизин-позитивных гранул, которые как мелкие, так и крупные, часто образуют интенсивно окрашенные скопления и в большом количестве встречаются не только в нейропиле, но и на поверхности тел нейронов (плотность расположения гранул можно оценить как 4+) (см. рисунок, в). Во всех частях NRD встречаются единичные пары прилежащих друг к другу тел нейронов. При дефиците серотонина в последнюю неделю внутриутробного развития у животных на 5-е сутки постнатального развития в NRD-d, NRD-v и NRD-l нейроны имеют значимо меньший размер тел, чем в контроле (103±9 и 164±5 мкм2 соответственно), и располагаются ближе друг к другу, что свидетельствует о задержке общего развития NRD и меньшей степени развития нейропиля, где цитоплазма некоторых отростков сохраняет иммунопозитивную реакцию на синаптофизин. Плотность расположения синаптофизинпозитивных гранул в NRD-d значительно ниже (2+), чем в контроле (см. рисунок, г), однако выше, чем в NRD-v и NRD-l (1+), как правило, гранулы одиночные, мелкие или крупные, их скоплений практически нет. На поверхности тел нейронов присутствуют немногочисленные одиночные гранулы. К 20-м суткам у животных в контроле в NRD- d, NRD-v и NRD-l тела нейронов располагаются на значительном расстоянии друг от друга, что свидетельствует о высокой степени развития нейропиля, однако, наряду с этим, в ядре сохраняются единичные пары прилежащих друг к другу тел нейронов. В нейропиле в NRD-d, NRD-v и NRD-l плотность синаптофизин-позитивных гранул одинаково высокая (5+) и выше, чем в предыдущий срок исследования. На поверхности тела отдельных нейронов много иммунопозитивных гранул (как одиночных крупных, так и собранных в группы). У животных, испытывавших дефицит серотонина в последнюю неделю внутриутробного развития, в NRD-d, NRD-v и NRD-l размеры тел нейронов значимо меньше, чем в контроле (156±18 и 251±13 мкм2 соответственно). Сохраняются попарно лежащие тела нейронов. В нейропиле NRD-d плотность расположения синаптофизинпозитивных гранул практически не отличается от таковой в контроле (5+). На поверхности тел нейронов располагаются в основном крупные одиночные гранулы. Как в NRD-v, так и в NRD-l общая плотность расположения синаптофизинпозитивных гранул (мест контактов) на поверхности отростков и тел нейронов оказалась примерно одинаковой (3+), однако ниже, чем в NRD-d, и гораздо ниже, чем в контроле. Обсуждение полученных данных . Исследование показало, что у плодов крыс контрольной группы в NRD-d, NRD-v и NRD-l на 19-е сутки начинает развиваться нейропиль, и на поверхности отростков появляются синаптические контакты, а на 20-е сутки они впервые обнаруживаются на поверхности тел нейронов. На 19–20-е сутки в нейропиле всех частей NRD цитоплазма многих отростков нейронов дает иммунопозитивную реакцию на синаптофизин, что, видимо, свидетельствует о незрелости нейронов. Подобный факт был отмечен при исследовании синаптогенеза в мозгу мыши, где в цитоплазме отростков незрелых нейронов — как аксонов, так и дендритов — выявлялся синаптофизин. В зрелых нейронах синаптофизин определялся только в аксональных пресинаптических терминалях [9, 11]. Результаты нашего исследования показали, что уже на ранних стадиях развития синаптофизин-позитивные гранулы имеют разные размеры. Вероятно, синапсы в этот период отличаются по степени сложности своей организации, они могут быть простыми (т. е. иметь одну пре-и постсинаптическую активные зоны) и сложными (образованными большим числом пре-и постсинаптических зон, объединенных в единый структурно-функциональный комплекс), при этом диаметр синаптических контактов может составлять от 0,126 до 0,270 мкм [3]. Плотность расположения синаптофизин-позитивных гранул как на отростках в нейропиле, так и на поверхности тел нейронов резко и значительно увеличивается к 5-м суткам постнатального развития. В дальнейшем — к 20-м суткам она возрастает незначительно. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии серотонина на синаптогенез в NRD. Дефицит серотонина во второй половине внутриутробного развития приводит к значительной задержке синаптогенеза в NRD как в пре-, так и в ранний постнатальный периоды. К концу пренатального развития, в отличие от контроля, в нейропиле выявляются редкие синаптические контакты, а на телах нейронов контакты вообще отсутствуют. В ранний постнатальный период плотность расположения контактов увеличивается, однако на отростках как в нейропиле, так и на телах нейронов при дефиците серотонина она значительно ниже, чем в контроле. К 20-м суткам постнатального развития плотность расположения синаптических контактов возрастает не одинаково в разных частях NRD: в NRD-d она приближается к таковой в контроле, ав NRD-v и NRD-l остается сниженной. Возможно, разница в плотности расположения синапсов в разных частях NRD отражает как региональные различия в постсинаптических структурах клетокмишеней, так и их способность формировать постсинаптические структуры в зависимости от содержания серотонина. Увеличение количества синаптических контактов в NRD во время развития особи является отражением как повышения числа мест контактов между нейронами внутри ядра, так и увеличения числа установленных контактов с нейронами и их отростками приходящих в NRD пресинаптических терминалей афферентных волокон. Существует мнение, что при этом формируются определенные моноаминергические нейрональные цепи, звеньями которых являются серотонинергические нейроны [12]. Возникающие посредством установления синаптических контактов нейрональные цепи, несомненно, оказываются функциональными еще до рождения. Задержка или нарушение синаптогенеза может приводить к изменению взаимодействия серотонинергических нейронов с нейронами других формаций мозга. Как в пре-, так и в постнатальный период в NRD обнаруживаются прилежащие друг к другу (расположенные попарно или группами до 5) тела нейронов, образующие между собой сомато-соматические контакты [12]. При дефиците серотонина такие группы встречаются значительно чаще, чем в контроле. Их существование между нейронами NRD было ранее отмечено в развивающемся мозгу у мышей [12], однако функции этих контактов до сих пор неизвестны. В настоящее время роль и значение сомато-соматических контактов, имеющих место до и во время синаптогенеза, могут быть только гипотетическими. Вероятно, эти контакты служат для удерживания нейрональных клеток вместе во время, когда формируются функционально однотипные клеточные группы. Возможно, контакты образуются непосредственно после миграции этих клеток к их дефинитивному месту расположения и представляют собой способ «узнавания местоположения», позволяющий формировать такие однотипные нейральные группы [12].

About the authors

L. I. Khozhai

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru

V. A. Otellin

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

References

Supplementary files