METHODOLOGICAL APPROACHES TO THE COMPLEX STUDY OF THE FUNCTIO NAL MORPHOLOGY OF THE TRACHEAL EPITHELIAL LINING IN THE EXPERIMENT

Full Text

В основе мукоцилиарного транспорта (МЦТ) — важнейшей защитной функции слизистой оболочки воздухоносных путей — лежит эффективная работа ресничного аппарата многорядного реснитчатого эпителия, погруженного в жидкий перицилиарный слой и перемещающего за счет биения ресничек более вязкий поверхностный слой слизи, между этими слоями расположен тонкий слой сурфактанта [4, 11]. Большинство предложенных различными авторами методических подходов к изучению МЦТ и двигательной активности ресничного аппарата (ДАРА) разработаны для клинической диагностики [4, 5, 7, 9, 12]. Вопросы адаптации данных методик к экспериментальным исследованиям на лабораторных животных в литературе освещены менее подробно [3, 8]; лишь в единичных публикациях приведены результаты сочетанного изучения показателей МЦТ, ДАРА и микроскопической структуры эпителиального пласта [6]. Поэтому выбор эффективного и информативного алгоритма исследования структурных и функциональных параметров эпителиальной выстилки воздухоносных путей у одних и тех же экспериментальных животных с использованием современной цифровой техники и программного обеспечения продолжает оставаться актуальной задачей. На кафедре гистологии Ярославской государственной медицинской академии разработан алгоритм комплексного функционального и морфологического анализа трахеи мелких лабораторных животных (белые крысы Вистар), включающий последовательную оценку скорости движения слизи in vivo и ДАРА in vitro в сочетании с гистологическим исследованием слизистой оболочки воздухоносных путей (рис. 1). Использованные методики прижизненного исследования включают создание и сохранение оцифрованных видеофайлов с их последующей визуальной оценкой и математическим анализом изучаемых параметров. 1. Исследование скорости движения слизи in vivo. Организация эксперимента. Использована модифицированная методика измерения скорости МЦТ у лягушек, основанная на регистрации перемещения инертного маркера по поверхности слизистой оболочки [2]. Общий вид используемой системы наблюдения и регистрации представлен на рис. 2, а. Наркотизированное животное (уретановый наркоз, 1000 мг/кг, внутрибрюшинно) фиксируют на специальном термостолике (32 °С). После послойного обнажения трахеи на вентральной поверхности последней производят разрез скальпелем (см. рис. 1, а) таким образом, чтобы после удаления участка стенки в области надреза получился участок трахеи длиной 8–10 мм в виде полуоткрытой трубочки (см. рис. 1, б). На раскрытые края трахеи накладывают высушенное покровное стекло с нанесенной шкалой (шаг деления — 0,1 мм), предварительно обработанное антифогом (противозапотевающей жидкостью), что обеспечивает герметизацию трахеи и сохранение эффективных дыхательных движений, препятствует высыханию слизистой оболочки и позволяет осуществлять замеры (см. рис. 2, б). Трахею орошают подогретым до 32±0,5 °С раствором — средой Игла МЕМ с L-глутамином (производитель — предприятие по производству бактериальных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, Москва). В качестве инертного маркера используют мелкоизмельченные частицы активированного угля, предварительно смешанные с подогретой средой. Шейную часть наркотизированного животного помещают под объектив бинокулярного стереомикроскопа МБС-1 (ЛОМО, СССР) с боковым освещением, в один из окуляров которого помещена цифровая камера WEBBERS Myscope 200M CCD (Webbers, КНР) с выводом данных на монитор компьютера; общее увеличение оптической системы 10. Создание видеофайла. На нижний край обнаженной слизистой оболочки трахеи помещают маркер, под контролем на экране монитора компьютера производят видеозахват сфокусированного изображения (см. рис. 2, в) с частотой 25 кадров/с с последующим сохранением видеофайла (продолжительность записи одного фрагмента составляет 3–5 мин). Общая продолжительность выполнения данного этапа — до 10–12 мин в расчете на 1 животное (без учета времени введения в наркоз). Математическая обработка. Во время изучения видеофайла программа видеосъемки Scopephoto 3.0.12.781 позволяет одновременно с изображением выводить на экран цифровой таймер с точностью до сотых долей секунды. На основании этого, рассчитывается скорость прохождения частицами маркера участка трахеи длиной 5–7 мм. 2. Исследование ДАРА in vitro, взятие материала для гистологического исследования. Организация эксперимента. В основу предлагаемых подходов к исследованию ДАРА в эксперименте на белых крысах положена методика прямой видеорегистрации, применяемая для изучения биоптатов эпителия носовой полости у человека [1, 10, 11]. Для проведения исследований использован программноаппаратный комплекс (НПО Азимут, Россия), включающий в себя микроскоп Микмед-6 (ЛОМО, СССР) с термостоликом, высокочастотную аналоговую видеокамеру Эндокам-600К, компьютер с платой захвата высокочастотного видеосигнала Raster RT851 и специальное программное обеспечение MOSFRO для измерения частоты движения колеблющихся объектов (рис. 3, а). Электронный блок термостатирования обеспечивает регулировку и поддержание стабильной температуры 32±0,5 °С как биоптата в процессе микроскопии (термостолик микроскопа), так и инструментария, предметных и покровных стекол, сосудов с питательной средой [отдельный термостатируемый столик (см. рис. 3, б)]. Использование высокочастотных камеры и платы видеозахвата позволяет проводить черно-белую запись изображения с частотой до 80 кадров/с. Создание видеофайла. После завершения съемки движения слизи по открытому фрагменту трахеи производят взятие поперечного среза кольца трахеи толщиной до 1 мм, смежного с открытым участком (см. рис. 1, в) и помещают его в лункообразное углубление предметного стекла, заполненное средой Игла МЕМ и предварительно нагретого на термостолике до 32 °С. Остальную часть трахеи помещают в фиксирующую среду (забуференный формалин, жидкость Буэна) для последующего гистологического и гистохимического изучения (см. рис. 1, г). Биоптат накрывают тонким покровным стеклом и помещают под микроскоп (об. 100 — масляная иммерсия), после чего производится поиск зоны с четкой видимостью движущихся ресничек реснитчатого эпителия. Изображение воспроизводится на мониторе компьютера в режиме реального времени. После нахождения одной из зон объекта при суммарном увеличении 1000 (об. 100, ок. 10) осуществляют захват сфокусированного изображения с последующим сохранением видеофайла (продолжительность записи одного фрагмента составляет 10–12 с). С одного образца записывают не менее трех видеофайлов. Общая продолжительность данного этапа — до 10–15 мин в расчете на 1 животное. Математическая обработка. Подсчет частоты движения ресничек проводится при помощи специальной компьютерной программы MOSFRO. Последняя позволяет воспроизводить всю запись, проводить покадровый просмотр, произвести подсчет частоты колебаний, а также рассчитать соотношение фаз мерцания ресничек, представленных в видеофрагменте. Для выполнения подсчета частоты колебаний ресничек и фаз их движения на монитор выводят начальный фрейм изучаемого видеофрагмента. На мониторе четко визуализируются реснички эпителия, на которые при помощи компьютерной мыши наносят идентификационные точки (см. рис. 3, в). После запуска видеофайла программа фиксирует изменение яркости в этих точках и рассчитывает частоту колебаний объектов (в Гц). Кроме того, при нанесении точек на основание и конец реснички автоматически рассчитывается высота последней. Все полученные результаты сохраняются в электронной базе данных, что позволяет наблюдать динамику изменения характеристик объектов и проводить статистический анализ. Предлагаемый алгоритм изучения гистофизиологии эпителиальной выстилки трахеи позволяет за короткий период времени (20–30 мин в расчете на одно животное) прижизненно зарегистрировать и задокументировать в цифровой форме изученные процессы и провести взятие материала для гистологического анализа стенки органа. Данная продолжительность эксперимента не влияет на изменение показателей МЦТ и ДАРА, что предварительно установлено в процессе отработки методик. Описанные подходы обеспечивают достаточно высокую воспроизводимость результатов (величины коэффициентов вариации изученных функциональных показателей в возрастных группах из 7–10 интактных животных не превышают 10–12%) и позволяют с максимальной эффективностью и информативностью провести комплексный морфофункциональный анализ исследуемого объекта.

About the authors

A. V. Pavlov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: pavlov@yma.ac.ru

L. I. Yesev

Yaroslavl’ State Medical Academy

References

Supplementary files