Morphological features of the innervation of the rat adrenal gland adipose tissue

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Актуальность исследования жировой ткани объясняется двумя причинами: во-первых, недостатком знаний об этиологии и патогенезе ожирения — одной из современных проблем нарушения метаболизма; во-вторых, недостаточностью знаний об эндокринной функции жировой ткани. Несмотря на то, что структурные и функциональные особенности жировой ткани изучаются в течение многих лет [1, 2], до сих пор недостаточно сведений об источниках её развития, цито- и гистогенезе адипоцитов, поддержании гомеостаза; неясна роль нервной системы в процессе развития ожирения. В последние годы широко изучается белая, бежевая и бурая жировая ткань разных органов млекопитающих [3–9]. Наши недавние исследования, выполненные с помощью иммуногистохимических методов, были посвящены особенностям иннервации разных типов жировой ткани околосердечной области в возрастном аспекте [10, 11]. Менее изученными остаются вопросы о строении, функциях, особенностях иннервации белой и бурой жировой ткани надпочечника.

Цель — изучение строения и иннервации жировой ткани надпочечника крысы с применением нейроиммуногистохимических маркёров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одноцентровое сплошное неконтролируемое неослеплённое исследование.

Объектом исследования служили фрагменты жировой ткани надпочечника крыс линии Вистар массой 200–250 г (n=10). При работе с животными соблюдали этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Материал фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида в течение одних суток [12] и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Rotary 3003 (PFM, Германия). На срезах проводили иммуногистохимические реакции для выявления трёх нейральных маркёров: тирозингидроксилазы (tyrosine hydroxylase, ТН) — для идентификации катехоламинергических структур; белка PGP 9.5 — для холинергических структур; синаптофизина (Syn) — для терминальных синаптических структур. Применяли поликлональные кроличьи антитела к белку PGP 9.5 (Spring Bioscience, США); поликлональные кроличьи антитела к Syn (MONOSAN, Нидерланды); поликлональные кроличьи антитела в разведении 1:1000 к ТН (Abcam, Великобритания). Первичные антитела в нужном разведении наносили на гистологические срезы после депарафинирования на одни сутки. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Reveal Polyvalent HRP/DAB Detection System kit (Spring Bioscience, США). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим и астровым синим. Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM750 (Leica Microsystems, Германия) и цифровой камеры Leica ICC50 (Leica Microsystems, Германия).

Этическая экспертиза

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/22 от 06.04.2022).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что у половозрелых животных надпочечники, как правило, находились в окружении жировой ткани. Она располагалась неравномерно. Бóльшая её часть в виде купола или подушки локализовалась в области ворот, в месте входа нервно-сосудистого пучка в орган; меньшая часть, исключительно белая, располагалась в виде узкой полоски, прилежащей вплотную к фиброзной капсуле, и была представлена лишь 1–2 слоями дифференцированных белых адипоцитов. В куполообразной жировой ткани нередко встречались различных размеров (от 300 до 550 мкм) и формы дольки, состоящие из двух типов тканей, построенных соответственно из белых и бурых адипоцитов (рис. 1).

 

Рис. 1. Общий вид жировой ткани. Здесь: Бр — бурая жировая ткань; Бл — белая жировая ткань; КНП — кора надпочечника. Окраска астровым синим; ×100.

Fig. 1. General view of adipose tissue. Here: Бр — brown adipose tissue; Бл — white adipose tissue; КНП — adrenal cortex. Aster blue staining; ×100.

 

В дольках чаще преобладала белая жировая ткань. Однако объём и концентрация той и другой ткани зависят от функционального состояния органа каждого отдельного животного. Адипоциты белой жировой ткани имели крупные размеры (30–55 мкм и более), округлую или кольцевидную, реже полигональную, форму тела, сдвинутое на самую периферию уплощённое ядро и гигантскую липидную вакуоль в цитоплазме.

Бурые адипоциты можно легко отличить от белых по форме, размерам (25–35 мкм) и структуре цитоплазмы. Для них характерны признаки секреторных эпителиальных элементов: большой объём цитоплазмы, центрально расположенное гиперхромное ядро с одним-двумя ядрышками. В хорошо окрашенной толуидиновым синим ячеистого вида цитоплазме различались многочисленные микровезикулярные структуры, гранулы, а также средних и крупных размеров вакуоли. На поперечных срезах в одной дольке наблюдались неравномерно располагающиеся очаги как белой, так и бурой ткани, вариабельные по занимаемой площади. Причём между ними не отмечено чёткой границы. В жировой ткани долек мы выделяем клетки, находящиеся на различных стадиях дифференцировки: малодифференцированные — преадипоциты, дифференцирующиеся и зрелые (белые и бурые) — адипоциты. Между белыми и бурыми элементами встречались также клетки переходной формы. В жировой ткани надпочечника половозрелых животных преобладали дольки, состоящие из различных адипоцитов, — это так называемая смешанная жировая ткань. Для её клеток характерно наличие в цитоплазме кроме микровезикулярных структур также средних и относительно крупных размеров липидных вакуолей.

В одном случае неожиданной находкой оказалось обнаружение, помимо обычных долек, обособленно расположенного у самой поверхности жировой подушки относительно крупного размера (150 на 250 мкм) и овальной формы эпителиального тельца (рис. 2). Его клетки по гистологическим признакам, по окраске цитоплазмы сходны, с одной стороны, с адипоцитами бурой жировой ткани, а с другой — клетками коры надпочечника (рис. 2). Функция этого тканевого образования для нас остаётся неизвестной. Возможно, оно представляет собой недифференцированный фрагмент развивающегося надпочечника, оставшийся в области жировой ткани при миграции клеток-предшественников в эмбриональный период развития.

 

Рис. 2. Общий вид (а) и фрагмент (b) остаточного тельца в жировой ткани надпочечника. Окраска толуидиновым синим. ×100 (а); ×400 (b).

Fig. 2. General view (a) and fragment (b) of the residual body in the adipose tissue of the adrenal gland. Toluidine blue staining. ×100 (a); ×400 (b).

 

Жировая ткань надпочечника была достаточно хорошо васкуляризирована и иннервирована. На поперечных срезах при малых увеличениях в междольковой соединительной ткани обнаружены многочисленные тонкостенные лимфатические сосуды, мелкие артерии и вены. Иногда артериальные веточки проникали в дольку и ветвились, образуя сеть из более мелких сосудов. На поперечных срезах имелись различия в плотности расположения кровеносных сосудов в паренхиме белой и бурой жировой ткани. В бурой чаще встречались тонкостенные венулы и расширенные капилляры, а в белой — артериолы и венулы, в то время как типичные обменные капилляры различались. В белой ткани капилляры располагались разреженно, многие из них находились в состоянии облитерации и, вероятно, выполняли функцию резервных.

Применение специальных иммуногистохимических маркёров белка PGP 9.5 и ТН показало, что жировая ткань надпочечников хорошо иннервирована. В ней выявлялись два основных типа иммунореактивных структур симпатического и парасимпатического отделов автономной нервной системы. Встречались фрагменты смешанных нервных стволиков, пучков и сплетений немиелинизированных нервных волокон, иногда микроганглии, островки и группы катехоламинергических секреторных клеток (хромаффинных клеток).

Проводящими путями для нервных структур, иннервирующих ткани долек, служат артериальные сосуды. Они проникают в дольки вместе с окружающими их сплетениями безмиелиновых нервных волокон. Установлено, что крупные, средние и мелкие артерии и артериолы вплоть до капилляров окружены непрерывной плотной сетью терминальных аксональных тяжей с дистантными синапсами типа en passant (тип синапсов, характерный для периферической нервной системы, для иннервации гладкомышечных клеток стенок кишечника, мочевого пузыря, артерий и др.; при этом типе передачи нейромедиаторы выделяются из варикозностей нервных терминалей на расстояние 200–300 нм и более). Сравнительный иммуногистохимический анализ показал, что среди тончайших тяжей этого сплетения находились как ТН⁺ (рис. 3), так PGP 9.5⁺ аксоны (рис. 4).

В бурой и белой жировой ткани выявлялись как те, так и другие терминальные нервные сплетения из проводников разной медиаторной природы: TH⁺ симпатических и PGP 9.5⁺ парасимпатических нервных волокон. Отмечено, что по интенсивности иннервации в дольках, состоящих из бурой и смешанной жировой ткани, преобладали симпатические терминальные структуры по сравнению с парасимпатическими. В крупных скоплениях белой жировой ткани и в дольках, состоящих из белых адипоцитов, иннервация была выражена очень слабо (см. рис. 3 и 4).

 

Рис. 3. Тирозингидроксилаза-иммунопозитивные нервные структуры в жировой ткани. Здесь: Бр — бурая жировая ткань; Бл — белая жировая ткань; ↑↑ — нервные структуры. Иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу, подкраска гематоксилином; ×400.

Fig. 3. Tyrosine hydroxylase-immunopositive nerve structures in adipose tissue. Here: Бр — brown adipose tissue; Бл — white adipose tissue; ↑↑ — nerve structures. Immunohistochemical reaction to tyrosine hydroxylase, hematoxylin staining; ×400.

 

Рис. 4. PGP 9.5+ нервные структуры в жировой ткани надпочечника. Здесь: Бр — бурая жировая ткань; Бл — белая жировая ткань, МГ — микроганглии, НП — нервные пучки, КН — корковая зона надпочечника. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5, подкраска толуидиновым синим; ×100.

Fig. 4. PGP 9.5⁺ nerve structures in the adipose tissue of the adrenal gland. Here: Бр — brown adipose tissue; Бл — white adipose tissue, МГ — microganglia, НП — nerve bundles, КН — adrenal cortex. Immunohistochemical reaction to PGP 9.5 protein, toluidine blue staining; ×100.

 

На поперечных срезах среди массы белых адипоцитов встречались лишь единичные пучки и тяжи претерминальных и терминальных варикозных аксонов, располагающихся вокруг сосудов. С помощью реакции на Syn удалось выявить многочисленные тончайшие Syn⁺ нервные окончания, тесно связанные не только с гладкомышечными клетками стенок сосудов, с эндотелием капилляров, но и с бурыми адипоцитами. При больших увеличениях можно было видеть, что часть синаптических окончаний располагается между клетками белой и бурой жировой ткани (рис. 5).

 

Рис. 5. Синаптофизин-иммунопозитивные терминальные варикозные структуры вокруг артериолы (a) и в паренхиме очагов бурых адипоцитов (b). Здесь: А — артериола, Бр — бурая жировая ткань, Бл — белая жировая ткань, ↑↑ — синаптические терминали. Иммуногистохимическая реакция на синаптофизин; ×400.

Fig. 5. Synaptophysin-immunopositive terminal varicose structures around the arteriole (a) and in the parenchyma of brown adipose tissue (b). Here: A — arteriole, Бр — brown adipose tissue, Бл — white adipose tissue, ↑↑ — synaptic terminals. Immunohistochemical reaction to synaptophysin; ×400.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализируя полученные данные, можно отметить, что у взрослых половозрелых крыс структуры жирового депо надпочечника достаточно хорошо иннервированы. С помощью нейроиммуногистохимических маркёров (белка PGP 9.5, TH и Syn) в дольках жировой ткани были выявлены нервные стволики, пучки и терминали. Отмечено, что в иннервации жировой ткани более существенную роль играют катехоламинергические (ТН⁺) нервные волокна.

В целом ряде работ, выполненных в основном на грызунах, в жировой ткани представлено сосуществование симпатической и пептидергической систем: D. Norman с соавт. показали это в межлопаточной и периренальной бурой жировой ткани [3]; A. Giordano с соавт. — в периовариальной жировой ткани [5]; J. Chi с соавт. — в паховой подкожной клетчатке [6]. Это также отмечено в ряде обзоров [13–15].

Результаты настоящей работы, выполненной с помощью иммуногистохимических методов, демонстрируют, что жировая ткань имеет вид подушки, состоящей из долек. Дольки заполнены различным объёмом бурых и белых адипоцитов. Встречаются иногда дольки с преобладанием того или иного типа адипоцитов. Иннервация долек осуществляется нервными волокнами, которые проникают в паренхиму в составе периваскулярных нервных сплетений, состоящих из тонких пучков и безмиелиновых тяжей варикозных аксонов. Установлено, что оба типа жировой ткани долек (белая и бурая) иннервируются как симпатическими (катехоламинергическими), так и парасимпатическими (холинергическими) волокнами. По данным работ [3, 5], в жировых депо висцеральных органов, в которых преобладают бурые адипоциты (кроме симпатических и парасимпатических волокон), описаны пептидергические аксоны, в которых присутствуют субстанции P, NPY, CGRP, SP. Таким образом, в бурой ткани находятся различного типа нервные аппараты, имеющие различный биохимический статус — медиаторный (холинергической и катехоламинергической природы) и регуляторных пептидов [3]. Результаты нашей работы, выполненной с использованием нейрональных маркёров: белка PGP 9.5, ТН и Syn, подтверждают данные литературы в отношении жировой ткани надпочечника и свидетельствуют о важной роли нервной и пептидергической регуляции функций жировой ткани для жизнедеятельности этого органа. Считается, что существует тесная связь нервной и нейроэндокринной регуляции липидного обмена со стороны центральной нервной системы и автономной части периферической нервной системы [16, 17]. Согласно концепции авторов [16, 17], автономная нервная система, в частности её симпатический отдел, обеспечивает регуляцию процессов метаболизма липидов под контролем гипоталамуса. В связи с этим большой интерес представляют исследования физиологов и клиницистов, в которых рассматриваются вопросы о взаимовлиянии жирового депо надпочечника и самого надпочечника, представленного корой надпочечника и его мозговым веществом, отличающимися большим разнообразием выделяемых гормонов [15, 18]. Предполагается, что кортикостероиды, секретируемые надпочечниками, контролируют функции жировой ткани посредством активации минералокортикоидных и глюкокортикоидных рецепторов, локализующихся на мембранах адипоцитов. В свою очередь адипоциты выделяют в кровоток большое разнообразие адипокинов и контролируют выработку кортикостероидов. В жировой ткани активация минералокортикоидных рецепторов глюкокортикоидами и глюкокортикоидных рецепторов альдостероном влияет на такие важные процессы, как цитодифференцировка адипоцитов, окислительный стресс, аутофагия, экспрессия адипокинов, а также локальная выработка глюкокортикоидных рецепторов за счёт усиления регуляции фермента 11β-гидроксистероиддегидрогеназа 1-го типа [18]. Таким образом объясняются механизмы взаимного влияния жировой ткани, гипоталамо-гипофизарной системы и надпочечников, включая регуляцию метаболизма адипоцитов гормонами коры надпочечников, с одной стороны, и влияние адипоцитов и адипоцитокинов на секрецию, метаболизм и действие стероидных гормонов в клетках-мишенях — с другой [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью иммуногистохимических реакций на белок PGP 9.5, тирозингидроксилазу и синаптофизин показано, что в белой и бурой жировой ткани надпочечника крысы выявлены различной медиаторной природы безмиелиновые нервные волокна, катехоламинергические и холинергические нервные терминальные аппараты. Установлено, что парасимпатические и симпатические постганглионарные нервные волокна проникают в дольки жировой ткани в составе периваскулярных нервных сплетений по артериальным сосудам. В них ремаковские тяжи варикозных аксонов интенсивно ветвятся и формируют терминальные синаптические сети типа en passant, которые участвуют в иннервации адипоцитов. Основная масса симпатических и парасимпатических синаптических структур локализуется преимущественно в очагах бурой и смешанной жировой ткани, где симпатические нервные волокна не только находятся в тесной связи со стенками артериальных сосудов, но и контактируют с бурыми адипоцитами, в то время как в белой жировой ткани тяжи варикозных аксонов выявляются главным образом вокруг артериальных сосудов и в минимальном количестве встречаются между дифференцированными кольцевидными адипоцитами. Это связано с тем, что в отличие от белых адипоцитов клетки бурой жировой ткани выполняют секреторную функцию. Вырабатывая адипокины, они влияют на выработку кортикостероидов надпочечником. Полученные данные позволяют предположить, что этот процесс находится под контролем симпатической нервной системы.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» № 122020300199-5.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Е.И. Чумасов — концепция исследования, сбор и анализ литературных данных, написание и редактирование текста статьи; Е.С. Петрова — изготовление препаратов, проведение иммуногистохимических реакций, анализ материала, написание текста статьи; Д.Э. Коржевский —написание и редактирование текста статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The work was carried out within the framework of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine No. 122020300199-5.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

E.I. Chumasov — idea of the study, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; E.S. Petrova — preparation of histological slides, carrying out immunohistochemical reactions, analysis of material, writing the article; D.E. Korzhevskii — writing the text and editing the article.

About the authors

Evgenii I. Chumasov

Institute of Experimental Medicine; Saint Petersburg State University of Veterinary Medicine

Author for correspondence.
Email: ua1ct@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4859-6766
SPIN-code: 2569-9148

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Elena S. Petrova

Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0972-8658
SPIN-code: 3973-1421

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitriy E. Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-code: 3252-3029

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files