Distribution of vimentin in the human pancreatic islets in type 2 diabetes

Full Text

Обоснование

Белок промежуточных филаментов виментин служит маркером клеток с мезенхимальным фенотипом и обычно не используется в исследованиях эндокринного отдела поджелудочной железы. Однако в ряде работ установлено, что виментин может экспрессироваться в эпителиоцитах протоков и эндокринных клетках (β и α) островков поджелудочной железы при ее развитии и регенерации [1-4], а также при сахарном диабете 2 типа (СД2) [5-7].

Причины появления виментин-положительных эндокринных клеток при СД2 до конца не ясны. По мнению ряда авторов, экспрессия виментина может наблюдаться в ходе дедифференцировки эпителиоцитов протоков в прогениторные клетки и их последующей дифференцировки в β-клетки при возобновлении их массы у больных диабетом [3, 5]. В пользу этой гипотезы свидетельствуют результаты исследований на млекопитающих (мышь, крыса, овца), демонстрирующие, что виментин экспрессируется в эпителиальных клетках протоков и некоторых β- и α-клетках при развитии и регенерации поджелудочной железы [1-4]. Причем в части этих клеток одновременно экспрессируются маркеры пролиферации (PCNA, Proliferating cell nuclear antigen) и транскрипционные факторы Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1), Ngn3 (Neurogenin 3) [3, 8]. При развитии поджелудочной железы Pdx1 играет ключевую роль в образовании дорсального и вентрального зачатков и, позднее, в созревании β-клеток. Экспрессия Ngn3 необходима для дифференцировки всех типов эндокринных клеток. Многие авторы рассматривают присутствие клеток, коэкспрессирующих виментин с маркерами эпителиальных клеток (цитокератин 20, Е-кадгерин, бета-катенин) и гормонами эндокринных клеток (инсулином, глюкагоном), как доказательство участия процессов эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) и мезенхимально-эпителиальной трансформации (МЭТ) в морфогенезе поджелудочной железы и, в частности, ее эндокринного отдела [2, 5, 9]. Процесс ЭМТ широко распространен в биологии развития и заключается в выселении мигрирующих мезенхимальных клеток из эпителия [9, 10]. МЭТ является обратным процессом и заключается в агрегации мезенхимальных клеток в эпителиальные структуры [9]. Способность эпителиальных клеток к выселению, миграции и агрегации лежит в основе многих эмбриологических (гаструляция, формирование нервного гребня, развитие сердца и почек, сомитогенез) и патологических (регенерация тканей, заживление ран, фиброзы, метастазирование опухолей) процессов [9]. Считается, что при развитии поджелудочной железы процессы ЭМТ и МЭТ лежат в основе одного из механизмов образования панкреатических островков и нарастания массы эндокринных клеток – выселения клеток-предшественниц из эпителия протоков, их последующей миграции и агрегации в островки [1, 9, 11]. Таким образом, активация экспрессии виментина в эпителиоцитах протоков и эндокринных клетках поджелудочной железы при СД2 может свидетельствовать о регенерации массы β-клеток в ответ на увеличение потребности в инсулине.

В других исследованиях показано, что в островках поджелудочной железы лиц с СД2 присутствуют клетки, коэкспрессирующие виментин с инсулином, виментин с глюкагоном и инсулин с глюкагоном [6, 7]. В связи с чем высказано предположение, что экспрессия виментина может наблюдаться при дедифференцировке β-клеток в незрелые фенотипы и их перепрограммировании в α-клетки, что приводит к снижению массы β-клеток, нарастанию дисфункции островков и возникновению диабета [6, 7].

Однако исследования, оценивающие взаимосвязь между нарастанием количества виментин-положительных эндокринных клеток и состоянием эндокринного отдела поджелудочной железы, ранее не проводились.

Цель

Цель данного исследования – сопоставить распределение виментина в панкреатических островках людей при сахарном диабете 2 типа и в отсутствии нарушений углеводного обмена с характеристиками эндокринного отдела поджелудочной железы.

Материалы и Методы

Исследован аутопсийный материал поджелудочной железы 13 лиц (возраст 42-82 года), страдавших СД2, и 9 лиц (возраст 61-88 лет) без нарушений углеводного обмена (группа сравнения) из коллекции лаборатории развития нервной системы НИИМЧ им. ак. А.П. Авцына. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института морфологии человека им. ак. А.П. Авцына (Протокол №33(9) от 07 февраля 2022 года). Данные о половозрастных характеристиках лиц с СД2 и из группы сравнения представлены в дополнительной таблице 1. Кусочки из тела поджелудочной железы размером 1х1х0,5 см фиксировали в нейтральном формалине (4% параформальдегид на 0,1М фосфатном буфере, рН 7,0–7,4) (Биовитрум) не позднее чем через 8 часов после смерти, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и диоксане, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 7 мкм.

На парафиновых срезах проводили реакции двойного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием следующих комбинаций антител: кроличьи моноклональные антитела к виментину (1:50, Thermo Fisher Scientific Inc., Кат. № RM-9120-S1) + мышиные моноклональные антитела к инсулину (1:1000, Sigma, Кат. №I2018); кроличьи моноклональные антитела к виментину (Thermo Fisher Scientific Inc., Кат. № RM-9120-S1) + мышиные моноклональные антитела к глюкагону (1:1000, Sigma, Кат. № G2654). При проведении реакций срезы депарафинировали, регидратировали и инкубировали с 10% раствором нормальной козьей сыворотки (Santa Cruz Biotechnology) в трис-буферном растворе, содержащем 0,1% Tween20 (TBST) (Thermo Fisher Scientific Inc.) для блокировки неспецифического связывания. Первичные антитела разводили в 10% растворе нормальной козьей сыворотки в TBST и инкубировали со срезами в течение 12 часов при +4^оС. В качестве вторичных антител применяли AlexaFluor^®488 goat anti-mouse IgG (H+L) (1:200, Thermo Fisher Scientific Inc., Кат. № A11029) и AlexaFluor^®555 goat anti-rabbit IgG (H+L) (1:200, Thermo Fisher Scientific Inc., Кат. № A21429). Вторичные антитела разводили в TBST и инкубировали со срезами в течение 2 часов при комнатной температуре. Для заключения срезов применяли среду, содержащую DAPI (Fluoroshield™ with DAPI) (Sigma, Кат. № F6057). В каждую реакцию для каждого образца включали негативные контроли, в которых первичные антитела заменяли 10% раствором нормальной козьей сыворотки в TBST.

Полученные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа (Микромед 3 ЛЮМ LED), оснащенного видеокамерой (Toupcam) и соответствующим программным обеспечением (ToupView 3.7).

Морфометрический анализ проводили в программе Image Scope M (Системы для микроскопии и анализа, Москва, Россия). Изображения для анализа получали с 8 срезов на образец (4 среза, окрашенных антителами к виментину и инсулину; 4 среза, окрашенных антителами к виментину и глюкагону); интервал между срезами составлял 200-210 мкм. Для каждого образца не менее чем в 40 непересекающихся кадрах при увеличении х100 измеряли плотность распределения панкреатических островков (количество островков в кадре), относительную площадь β- и α-клеток (процент площади среза, занимаемый окрашенной цитоплазмой β- или α-клеток), измеряли диаметр (расстояние по наибольшей оси) каждого островка в кадре. Затем вычисляли среднее значение для каждого параметра. Для оценки распределения виментина анализировали по 50 панкреатических островков на срезах, окрашенных антителами к виментину и инсулину, и 50 панкреатических островков на срезах, окрашенных антителами к виментину и глюкагону, на образец при увеличении х200. Для каждого островка отмечали наличие/отсутствие виментин-положительных клеток, подсчитывали количество виментин-положительных клеток, количество виментин-положительных клеток, содержащих инсулин, количество виментин-положительных клеток, содержащих глюкагон, а затем вычисляли процент островков, содержащих виментин-положительные клетки, среднее количество виментин-положительных клеток на островок, процент виментин-положительных клеток, содержащих инсулин, и процент виментин-положительных клеток, содержащих глюкагон.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Statistica 10 (Statsoft Inc., Талса, США). Поскольку количество наблюдений в исследуемых группах различалось, а распределение исследуемых параметров отличалось от нормального, для сравнения исследуемых параметров применяли непараметрический критерий – U-тест Манна-Уитни. Данные представляли как медиану и верхний и нижний квартили (Me:q1-q3). Критический уровень значимости в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты

Во всех исследованных образцах поджелудочной железы лиц с СД2 в панкреатических островках обнаружены крупные клетки с яркой иммуноположительной реакцией на виментин (рис. 1). Эти клетки располагались на периферии панкреатических островков или вблизи капилляров, часто контактировали с гормон-положительными клетками, и отличались от виментин-положительных эндотелиальных клеток и клеток соединительной ткани по форме и распределению иммунореактивности к виментину. Стромальные клетки были преимущественно удлиненной, реже овальной формы, с тонким ободком цитоплазмы вокруг ядра и длинными отростками; положительное окрашивание на виментин наблюдалось в цитоплазме вокруг ядра и в отростках. Кроме того, в строме железы присутствовали полигональные клетки с отростками, в которых при реакции на виментин окрашивались разнонаправленные филаменты в цитоплазме. В уплощенных эндотелиоцитах, образующих выстилку сосудов, окрашивание на виментин наблюдалось в цитоплазме. В составе панкреатических островков, наряду со стромальными и эндотелиальными клетками, присутствовали виментин-положительные клетки, характерными морфологическими отличиями которых были их округлая, овальная или полигональная форма, обильная цитоплазма вокруг ядра, и отсутствие отростков. В большинстве таких клеток иммунореактивность к виментину была равномерно распределена в цитоплазме. В некоторых клетках выявлялись только виментин-положительные филаменты в отдельных участках цитоплазмы. В части виментин-положительных клеток обнаружена колокализация виментина с инсулином (рис. 1 a–c) или глюкагоном (рис. 1 d–f). Сходные виментин-положительные клетки, часть из которых одновременно содержат инсулин или глюкагон, присутствовали и в панкреатических островках у лиц из группы сравнения. Однако в панкреатических островках у лиц из группы сравнения виментин-положительные клетки встречались реже, чем у лиц с СД2.

Для подтверждения качественных наблюдений был проведен количественный морфометрический анализ. Средние значения исследованных морфометрических параметров в каждом случае представлены в дополнительной таблице 1. Медианы и межквартильный интервал исследованных параметров в группе лиц с СД2 и группе сравнения представлены в дополнительной таблице 2. В результате установлено, что все параметры, отражающие распределение виментина в панкреатических островках (процент островков, содержащих виментин-положительные клетки; среднее количество виментин-положительных клеток в островке; процент виментин-положительных клеток, содержащих инсулин; процент виментин-положительных клеток, содержащих глюкагон) в группе лиц с СД2 были достоверно выше, чем в группе сравнения (дополнительная таблица 2, рис. 2). Необходимо отметить, что в большинстве виментин-положительных клеток реакция на инсулин и глюкагон была иммунонегативной. Доля виментин-положительных клеток, содержащих инсулин, и виментин-положительных клеток, содержащих глюкагон, составляла 24.5% и 20.4% соответственно в группе лиц с СД2, и 13.6% и 12.9% соответственно в группе сравнения.

При анализе характеристик эндокринного отдела поджелудочной железы установлено, что плотность распределения панкреатических островков, средний диаметр панкреатических островков и относительная площадь β-клеток у лиц с СД2 не отличались от таковых в группе сравнения (дополнительная таблица 2, рис. 3 a–c). При этом у лиц с СД2 выявлено достоверное повышение относительной площади α-клеток (дополнительная таблица 2, рис. 3 d) и соответствующее снижение отношения  β-клеток к α-клеткам (дополнительная таблица 2, рис. 3 e). На морфологическом уровне повышение относительной площади α-клеток проявлялось присутствием в ткани железы большого количества панкреатических островков, в которых существенно преобладали глюкагон-положительные α-клетки (рис. 1 d–f).

Обсуждение

В результате проведенного исследования показано, что виментин-положительные клетки, часть из которых содержат инсулин или глюкагон, присутствуют в панкреатических островках как у лиц СД2, так у лиц, не страдавших нарушениями углеводного обмена. Полученные количественные данные позволяют сделать вывод о том, что при СД2 количество виментин-положительных клеток нарастает. Наряду с этим, в эндокринном отделе поджелудочной железы, при неизменном размере панкреатических островков, плотности их распределения и относительной площади β-клеток, наблюдается нарастание относительной площади α-клеток.

Данные литературы об экспрессии виментина в поджелудочной железе человека немногочисленны и достаточно противоречивы. По мнению ряда авторов, экспрессия виментина в эндокринных клетках наблюдается при СД2 и не выявляется в нормальной поджелудочной железе взрослых людей [3, 5, 7, 12]. Полученные нами результаты согласуются с данным Роефса и соавт. [6], свидетельствующими о присутствии виментин-положительных β- и α-клеток в нормальной поджелудочной железе и нарастании их количества при СД2. Важно отметить, что в работах, выполненных на образцах поджелудочной железы взрослых людей, анализировали распределение иммунореактивности к виментину в инсулин- и глюкагон-положительных клетках [5–7]. При этом присутствие в панкреатических островках виментин-положительных клеток, не содержащих гормоны, не отмечалось. В ходе данного исследования установлено, что в панкреатических островках у взрослых людей присутствуют виментин-положительные клетки, которые по морфологическим характеристиками (округлая, овальная или полигональная форма, округлые ядра, отсутствие отростков) и распределению иммунореактивности к виментину (в большинстве клеток наблюдалось равномерное окрашивание на виментин в цитоплазме) отличались от виментин-положительных стромальных клеток и эндотелиоцитов. При этом колокализация виментина с инсулином или глюкагоном наблюдалась лишь в части из этих клеток. Таким образом, в панкреатических островках взрослых людей присутствуют виментин-положительные клетки, сходные по морфологии с виментин-положительными эндокринными клетками, но не содержащие гормоны. Происхождение этих клеток остается неясным. Сходные виментин-положительные клетки ранее описаны в панкреатических островках новорожденных с диабетической фетопатией [13], а также у крыс при моделировании диабета введением стрептозотоцина [14]. Предполагают, что такие клетки могут появляться в результате снижения экспрессии гормонов и активации экспрессии виментина в эндокринных клетках [14]. Однако нельзя полностью исключить тот факт, что, по крайней мере, часть из них представляет собой стромальные клетки или иные клетки мезенхимального происхождения, которые приобретают фенотип эндокринных клеток [14]. Кроме того, изменение фенотипа клеток с эпителиального на мезенхимальный, споровождающееся активацией экспрессии мезенхимальных маркеров в эпителиальных клетках, может наблюдаться при различных патологических процессах, таких как, например, фиброз и метастазирование опухолей [10]. Поэтому для детальной морфо-функциональной характеристики виминтин-положительных клеток, в части из которых содержатся гормоны, и определения их происхождения необходимы дальнейшие исследования с применением комплекса фенотипических маркеров и эксперименты с отслеживанием судьбы клеток.

Как было упомянуто во введении, активация экспрессии мезенхимальных маркеров может наблюдаться при дифференцировке эндокринных клеток в ходе нормального развития и регенерации поджелудочной железы [1–4], а также при дедифференцировке эндокринных клеток и перепрограммировании одних типов эндокринных клеток в другие [6, 7]. На сегодняшний день доказательства активации экспрессии виментина при неогенезе β-клеток у лиц с СД2 единичные и основываются преимущественно на фактах обнаружения иммунореактивности к виментину не только в эндокринных клетках, но и в эпителиоцитах протоков поджелудочной железы у лиц с СД2 [3, 5]. Однако виментин-положительные β-клетки у лиц с СД2 не экспрессируют транскрипционные факторы, необходимые для дифференцировки и созревания β-клеток– Pdx1, Nkx6.1 (Homeobox protein Nkx-6.1) [6]. Поэтому маловероятно, что такие клетки представляют собой дифференцирующиеся β-клетки. Исходя из экспериментальных данных, наиболее вероятной представляется активация экспрессии виментина при дедифференцировке эндокринных клеток в менее зрелые фенотипы и перепрограммировании одних типов эндокринных клеток в другие. Например, у крыс при практически полной (около 99%) абляции β-клеток путем однократного введения стрептозотоцина, в панкреатических островках обнаруживаются многочисленные округлые виментин-положительные клетки, коэкспрессирующие один из фенотипических маркеров α-клеток – MafB (Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B), который в α-клетках служит активатором экспрессии гена глюкагона. Эти клетки служат основным источником восстановления популяции инсулин-содержащих клеток при нормализации гликемии. По мнению авторов, при критическом снижении массы β-клеток запускается перепрограммирование α-клеток в β-клетки, сопровождающееся снижением экспрессии глюкагона и активацией экспрессии виментина в α-клетках, появлением виментин+/MafB+/глюкагон- клеток, которые впоследствии начинают экспрессировать инсулин [14]. С другой стороны, в литературе широко обсуждается феномен дегрануляции, дедифференцировки β-клеток и их перепрограммирования в α-клетки в условиях метаболического стресса [15–17]. Эти процессы также сопровождаются активацией экспрессии виментина в эндокринных клетках, что подтверждается как в экспериментальных исследованиях на животных [17], так и при культивировании эндокринных клеток поджелудочной железы человека [18]. Согласно нашим результатам, в панкреатических островках человека одновременно присутствуют клетки с различными фенотипами – экспрессирующие только виментин, а также коэкспрессирующие виментин с инсулином или глюкагоном, количество которых нарастает при СД2. На основании этих данных можно предположить, что в панкреатических островках человека происходят процессы дедифференцировки и перепрограммирования эндокринных клеток, активация которых наблюдается при СД2.

Вопрос о том какие процессы приводят к активации дедифференцировки и перепрограммированию эндокринных клеток при СД2 остается не решенным. Ранее нами показано, что виментин-положительные клетки, в части из которых содержатся инсулин или глюкагон, присутствуют в значительном количестве в панкреатических островках новорожденных от матерей с сахарным диабетом (новорожденные с диабетической фетопатией), у которых наблюдается гиперсекреция инсулина β-клетками вследствие развития плода в условиях гипергликемии [13]. При этом нарастание количества виментин-положительных клеток у новорожденных с диабетической фетопатией ассоциировано с характерными изменениями в эндокринном отделе поджелудочной железы – гипертрофией и гиперплазией панкреатических островков, нарастанием плотности β- и α-клеток [13]. Поэтому маловероятно, что появление виментин-положительных клеток в островках человека отражает перепрограммирование α-клеток в β-клетки при критической потере массы β-клеток, как это было показано при моделировании диабета у крыс [14]. Скорее всего, нарастание количества виментин-положительных клеток в панкреатических островках человека связано с воздействием гипергликемии или других ассоциированных с ней метаболических факторов.

В ходе данного исследования у лиц с СД2 выявлено нарастание относительной площади α-клеток и соответствующее снижение соотношения β- к α-клеткам по сравнению с группой лиц без нарушений углеводного обмена, при этом размер и плотность распределения панкреатических островков, а также относительная площадь β-клеток не отличались. Несмотря на существование значительных индивидуальных вариаций массы β- и α-клеток, в большинстве исследований отмечается снижение массы β-клеток у лиц с СД2 [19]. В ряде работ выявлено нарастание массы α-клеток при СД2 [19]. Отсутствие снижения массы β-клеток в исследованной нами группе лиц с СД2 вероятно обусловлено небольшим количеством наблюдений, которые не представлялось возможным подразделить на подгруппы в зависимости от индекса массы тела, резистентности к инсулину и других параметров. В то же время сходные с нашими данные, демонстрирующие нарастание массы α-клеток у лиц с СД2 при неизменной массе β-клеток, были получены и другими исследователями [20]. Полученные нами результаты позволяют говорить о том, что нарастание количества виментин-положительных клеток в панкреатических островках при СД2 ассоциировано с нарастанием плотности α-клеток. Можно предположить, что у лиц с СД2 гипергликимия или другие ассоциированные с диабетом метаболические факторы приводят к активации процессов дегрануляции и дедифференцировки β-клеток и их перепрограммированию в α-клетки, сопровождающиеся экспрессией виментина, как это было показано при моделировании диабета у животных [17] и в экспериментальных работах на культурах клеток [18].

Заключение

Активация экспрессии мезенхимального маркера виментина в эндокринных клетках связана с процессами эпителиально-мезенхимальной трансформации и мезенхимально-эпителиальной трансформации, которые могут наблюдаться как в ходе нормального развития и физиологического роста поджелудочной железы, так и при ее регенерации и возникновении различных патологий. При СД2 нарастание количества виментин-положительных клеток в панкреатических островках может отражать активацию неогенеза β-клеток, а также процессов дедифференцировки и перепрограммирования эндокринных клеток, таких как перепрограммирование α-клеток в β-клетки при критическом снижении массы β-клеток, или наоборот, процессов дедифференцировки β-клеток и их перепрограммирования в α-клетки при воздействии гипергликемии, приводящих к снижению массы β-клеток. В результате проведенного исследования установлено, что виментин-положительные клетки, в части из которых содержатся инсулин или глюкагон, присутствуют в панкреатических островках как у лиц с СД2, так и в отсутствии нарушений углеводного обмена. Однако при СД2 количество таких клеток возрастает. Причем нарастание количества виментин-положительных клеток в панкреатических островках у лиц с СД2 ассоциировано с нарастанием относительной площади α-клеток. Полученные нами результаты и данные литературы позволяют предположить, что появление виментин-положительных клеток в панкреатических островках связано с воздействием гипергликемии или других ассоциированных с ней метаболических факторов, и, вероятно, отражает процессы дедифференцировки и перепрограммирования эндокринных клеток, активация которых наблюдается при СД2.

Рисунки

 

Рис. 1. Виментин-положительные клетки (отмечены стрелками) в островках поджелудочной железы человека при СД2 (жен., 67 лет). a–c: двойное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к инсулину (зеленый) (b) и виментину (красный) (c); a – совмещенное изображение; ядра окрашены DAPI; укороченной стрелкой отмечена клетка с колокализацией виментина и инсулина. d–f: двойное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к глюкагону (зеленый) (d) и виментину (красный) (f); d – совмещенное изображение; ядра окрашены DAPI; укороченной стрелкой отмечена клетка с колокализацией виментина и глюкагона.

Fig. 1. Vimentin-positive cells (arrows) in the pancreatic islets of humans with T2D (woman, 67 years old). a–c: double immunofluorescent staining with antibodies to insulin (green) (b) and vimentin (red); a – merged image; nuclei are stained by DAPI; arrowhead indicates cell with co-localization of insulin and vimentin. d–f: double immunofluorescent staining with antibodies to glucagon (green) (b) and vimentin (red); d – merged image; nuclei are stained by DAPI; arrowhead indicates cell with co-localization of glucagon and vimentin.

 

Рис. 2. Распределение виментин-положительных клеток в панкреатических островках при СД2 и в группе сравнения: процент островков, содержащих виментин-положительные клетки (a); среднее количество виментин-положительных клеток в островке (b); процент виментин-положительных клеток, содержащих инсулин (c); процент виментин-положительных клеток, содержащих глюкагон (d). Значимые различия между группами (U-тест Манна-Уитни) отмечены квадратной скобкой с указанием критического уровня значимости (p).

Fig. 2. Distribution of vimentin-positive cells in the pancreatic islets in T2D and comparison group: percentage of islets containing vimentin-positive cells (a): average number of vimentin-positive cells per islet (b); percentage of vimentin-positive cells containing insulin (c); percentage of vimentin-positive cells containing glucagon (d). Significant differences between groups are marked by square bracket and p value.

 

Рис. 3. Характеристики эндокринного отдела поджелудочной железы при СД2 и в группе сравнения: плотность распределения панкреатических островков (количество островков в кадре) (a); средний диаметр панкреатических островков, µm (b); относительная площадь β-клеток (процент площади среза, занимаемый окрашенной цитоплазмой β-клеток) (c); относительная площадь α-клеток (процент площади среза, занимаемый окрашенной цитоплазмой α-клеток) (d); отношение β- к α-клеткам (e). Значимые различия между группами (U-тест Манна-Уитни) отмечены квадратной скобкой с указанием критического уровня значимости (p).

Fig. 3. Characteristics of the endocrine pancreas in T2D and comparison groups: Distribution density of islets (number of islets in the frame) (a); average diameter of islets, µm (b); relative area of β-cells (percentage of the section area occupied by the stained cytoplasm of β-cells) (c); relative area of α-cells (percentage of the section area occupied by the stained cytoplasm of α-cells) (d); β-to α-cells ratio (e). Significant differences between groups are marked by square bracket and p value.

About the authors

Yuliya S Krivova

Avtsyn Research institute of human morphology of Federal state budgetary scientific institution “Petrovsky national research centre of surgery”, Moscow, Russian Federation

Author for correspondence.
Email: homulkina@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-9692-3616
Russian Federation

Alexandra E. Proshchina

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: proshchina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0515-8275
SPIN-code: 8899-5104

Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor

Russian Federation, Moscow

Dmitry A Otlyga

Avtsyn Research institute of human morphology of Federal state budgetary scientific institution “Petrovsky national research centre of surgery”

Email: otlyga@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-6719-3383
SPIN-code: 7593-4951

Sergey V. Saveliev

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: braincase@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1447-7198
SPIN-code: 2079-6351
Scopus Author ID: 7006543630
ResearcherId: P-5675-2018

Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files