Патоморфологическая характеристика миокарда мышей с дисферлинопатией (линия Bla/J)

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Дисферлинопатия — это наследственная прогрессирующая мышечная дистрофия, проявляющаяся дистальным, проксимальным, проксимо-дистальным, а также врождённым вариантами клинических фенотипов [1]. Её распространённость в мире составляет до 1:200 000 новорождённых [2, 3]. Наследование заболевания преимущественно аутосомно-рецессивное, однако описан и доминантный тип [4, 5]. Причиной развития дисферлинопатии служат мутации в гене DYSF, локализованном в коротком плече второй хромосомы [4]. Основной функцией дисферлина является обеспечение репарации сарколеммы и эндоплазматического ретикулума мышечных волокон поперечнополосатой скелетной мускулатуры, однако значение этого белка для цито- и гистофизиологии кардиомиоцитов остаётся недостаточно изученным.

L.V. Anderson и соавт. [6] в 1999 году установили, что дисферлин экспрессируется с 5–6-й недели эмбриогенеза и выявляется во многих тканях организма человека, но влияет преимущественно на развитие мышечной ткани [6, 7]. При дефиците дисферлина наиболее выраженные патологические изменения возникают в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани. Накоплены обширные сведения о патоморфологических особенностях дистрофического процесса в скелетных мышцах как у животных, так и у людей [8–11]. Установлено, что в мышечных волокнах отмечаются разрывы и инвагинации сарколеммы, субсарколеммальные скопления везикул, вакуолизация, слияние митохондрий, расширение цистерн саркоплазматической сети, дезорганизация миофибрилл и Т-трубочек [8, 12]. Описанные изменения обусловлены неэффективностью внутриклеточной регенерации и, как следствие, некрозом, воспалением, липоидозом и фиброзом мышечных волокон [8, 13]. За последние 20 лет появились данные о значении дисферлина для функционирования миокарда [14–17]. Преимущественное исследование дистрофического процесса в скелетных мышцах обусловлено их приоритетным вовлечением и большей доступностью для гистологического исследования. Данные о гистопатологии миокарда при дисферлинопатии фрагментарны и ограничены, так как кардиомиопатия не имеет очевидных клинических проявлений до поздней стадии заболевания, а биопсийное исследование миокарда нецелесообразно.

Цель исследования — оценить патологические морфологические изменения в поперечнополосатой сердечной мышечной ткани при дисферлинопатии у мышей линии Bla/J в различные возрастные периоды.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое проспективное сплошное контролируемое нерандомизированное исследование. В качестве объекта исследования выбран миокард мышей, мутантных по гену DYSF, в качестве предмета — патоморфологические изменения миокарда модельных мышей линии Bla/J. Задачами исследования являлось определение и сравнение строения миокарда у мышей линии Bla/J с дисферлинопатией и мышей линии Balb/C без дисферлинопатии. Схема проведения исследования включала в себя качественную (наличие/отсутствие структурных и метаболических изменений) и количественную оценку кардиомиоцитов (исследование длины, толщины и периметра ядер кардиомиоцитов) на парафиновых срезах миокарда животных исследуемой и контрольной групп с последующей окраской и морфометрией. Изготовление парафиновых срезов проведено по классической методике [18]. Миокард левого желудочка мышей обеих групп исследован на наличие белка дисферлина с использованием иммунофлуоресцентного метода. Для этого фрагменты сердечной мышцы помещали в изопентан, охлаждённый в жидком азоте, толщина криосрезов — 10 мкм. Животных выводили из эксперимента путём декапитации.

Объекты (участники) исследования

В исследование включены мыши линии Bla/J, являющиеся моделью дисферлинопатии (линия создана путём вставки ретротранспозона в интрон 4) и мыши «дикого» типа линии Balb/C. Возраст животных — от 3 до 12 мес включительно.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе кафедры патологической анатомии Северо-Западного государственного медицинского университета имени И.И. Мечникова (Санкт-Петербург).

Основной исход исследования

Конечная точка исследования — описать патогистологические характеристики миокарда мышей с дисферлинопатией и сравнить их с характеристиками миокарда здоровых мышей.

Анализ в подгруппах

Исследуемая группа представлена 7 самцами мышей линии Bla/J в качестве модели дисферлинопатии в возрасте 3, 6 и 12 мес (3, 3 и 1 особь соответственно). Контрольная группа включала 2 здоровых самцов мышей линии Balb/C в возрасте 6 мес. Сравнение проводили внутри каждой из групп, а также между каждой возрастной подгруппой линий Bla/J и Balb/C.

Методы регистрации исходов

Препараты парафиновых срезов миокарда окрашивали гематоксилином и эозином, железным гематоксилином по Рего для оценки сохранности поперечной исчерченности поперечнополосатой мышечной ткани миокарда [19], ГОФПК по Ли для выявления признаков гипоксического повреждения кардиомиоцитов (ГОФПК — гематоксилин-основной фуксин-пикриновая кислота) [19].

Характеристику кардиомиоцитов осуществляли при помощи морфометрического учёта трёх параметров: расстояние между вставочными дисками (длина), толщина и периметр ядер (формат 2D в программе AxioVision v. 4.9.1, США).

На криосрезах ставили реакции с использованием первичных кроличьих моноклональных антител к дисферлину (ab124684, 1:200; Abcam, Великобритания). В качестве вторичных антител применяли Alexa Fluor 647 в разведении 1:200 (Invitrogen, США) с докраской ядер DAPI (Servicebio, Китай). Препараты сканировали в микроскопе Pannoramic 250 Flash (3DHISTECH, Венгрия).

Этическая экспертиза

Экспериментальная работа с животными одобрена локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (протокол № 14 от 08.02.2019 г.). Содержание мышей и все манипуляции с ними осуществляли в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 2006).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывали.

Для анализа результатов применён набор инструментов описательной и аналитической статистики, реализованный в программе Past v. 4.09 (Норвегия) [20]. Для проверки статистической однородности нескольких выборок использованы процедуры однофакторного (критерий Фридмана) и двухфакторного (критерий Краскела–Уоллиса) дисперсионного анализа. Центральные тенденции выборок представлены в виде средних значений (М) и медиан (Ме) в зависимости от соответствия/несоответствия нормальному распределению. Дисперсия центральных тенденций представлена в виде 95% доверительных интервалов (ДИ), рассчитанных методом бутстрэпа и Монте-Карло. Для последующего выявления неоднородных групп применяли процедуры множественных сравнений — критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони, для анализа корреляций — ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Линейная зависимость переменных описана с помощью уравнения парной линейной регрессии (y=bх+a), где b (slope — от англ. «наклон») — угловой коэффициент; a (intercept — от англ. «пересечение») — свободный член линии оценки, для которых также рассчитаны 95% ДИ. При проверке статистических гипотез ориентировались на р и 95% ДИ, а для изучаемых различий оценивали абсолютный и относительный размеры эффекта (effect size) [21, 22]. Относительный размер эффекта рассчитан по методу Коэна dC (Cohen). Доверительные интервалы для dC вычисляли с помощью электронной таблицы EffectSizeCalculator.xls и программы Effect Size Generator.xls. Для графической реализации данных использовали интерактивную программу BoxPlotR (http://shiny.chemgrid.org/boxplotr/).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Основные результаты исследования

У мышей линии Bla/J в возрасте 3 мес кардиомиоциты параллельно ориентированы, не деформированы, признаков дискомплексации нет. У животных в возрасте 6 мес расположение кардиомиоцитов непараллельное, а в возрасте 12 мес появляются признаки утраты комплексности ткани, волнообразная деформация мышечных клеток, также отмечено увеличение толщины (диаметра) кардиомиоцитов (рис. 1).

 

Рис. 1. Продольные срезы миокарда мышей линии Bla/J в возрасте 3 (a), 6 (b), 12 (c) мес. Окраска гематоксилином и эозином; ×200

Fig. 1. Axial section of myocardium in Bla/J mice 3 (a), 6 (b), 12 (c) months old. Hematoxylin and eosin dying; ×200

 

Морфометрические характеристики кардиомиоцитов животных Bla/J и контроля статистически значимо различались по ряду параметров (рис. 2).

 

Рис. 2. Морфометрические характеристики кардиомиоцитов мышей линии Bla/J и Balb/C: a — длина кардиомиоцитов; b — толщина (диаметр) кардиомиоцитов; c — периметр ядер кардиомиоцитов; * значение p при сравнении каждой из групп Bla/J c Balb/C по характеристике «длина кардиомиоцитов», ** значение p при сравнении каждой из групп Bla/J c Balb/C по характеристике «толщина кардиомиоцитов»

Fig. 2. Morphometric characteristics of cardiomyocytes in Bla/J and Balb/C mice: a — cardiomyocytes length; b — cardiomyocytes width (diameter); c — cardiomyocytes nucleus perimeter; * p-value in «cardiomyocytes length» comparison of every group of Bla/J mice with Balb/C mice, ** p-value in «cardiomyocytes width (diameter)» comparison of every group of Bla/J mice with Balb/C mice

 

Длина кардиомиоцитов мышей линии Bla/J на всех сроках была статистически значимо больше, чем у мышей контрольной группы, максимально — в возрасте 3 мес: 49,9 (45,9–57,4)% (95% ДИ), р=5,4×10^–48 (табл. 1). При этом исследуемые подгруппы животных линии Bla/J статистически значимо отличались друг от друга при наличии тренда на уменьшение длины кардиомиоцитов при увеличении возраста животных. Это явление описано уравнением линейной регрессии: y=–6,51х+254,33 (95% ДИ: slope –8,7; –4,2; intercept 240,8; 267,9; р=1,5×10^–6). Таким образом, возраст животных и длина кардиомиоцитов имеют линейное соотношение.

 

Таблица 1. Различия морфометрических параметров кардиомиоцитов мышей линий Bla/J и Balb/C разных возрастов

Table 1. Differences in morphometric parameters of cardiomyocytes of compared Bla/J and Balb/C mice groups in different age

Сравниваемые группы	Размер абсолютного эффекта, мкм (95% ДИ)	Размер относительного эффекта, % (95% ДИ)	Размер эффекта по Коэну	р
Длина кардиомиоцитов
Bla/J 3 мес и Bla/J 6 мес	21,39 (5,7–37,1)	12,8 (6,9–19,5)	–0,24	0,007
Bla/J 6 мес и Bla/J 12 мес	36,11(10,6–61,6)	37,9 (33,9–49.2)	–0,42	0,005
Bla/J 3 мес и Balb/C	113,7 (127,4–99,9)	49,9 (45,9–57,4)	–1,50	5,4×10–48
Bla/J 6 мес и Balb/C	92,3 (78,1–106,6)	42,9 (37,4–51,1)	–1,30	8,7×10–31
Bla/J 12 мес и Balb/C	56,2 (41,7–70,7)	34,6 (28,6–44,7)	–1,19	7,0×10–13
Толщина кардиомиоцитов
Bla/J 3 мес и Balb/C	22,1 (24,1–20,0)	34,0 (30,3–36,9)	–1,9	1,3×10–71
Bla/J 6 мес и Balb/C	22,6 (24,8–20,2)	35,6 (32,9–37,9)	–1,9	8,4×10–59
Bla/J 12 мес и Balb/C	21,9 (24,3–19,4)	33,4 (29,8–37,1)	–2,3	6,6×10–47
Периметр ядер
Bla/J 3 мес и Bla/J 6 мес	7,1 (0,1–6,4)	23,9 (20,2–27,5)	–0,11	0,04
Bla/J 6 мес и Balb/C	3,1 (24,8–20,2)	18,8 (8,5–19,7)	–1,9	8,4×10–59

Примечание: согласно вербальной шкале Коэна (абсолютные) значения dC от 0,2 до 0,5 трактуются как «слабый» эффект, от 0,5 до 0,8 — как «умеренный» эффект и значения dC ≥0,8 — как «сильный» эффект.

Note: according to the Cohen verbal scale (absolute) dC values from 0.2 to 0.5 are interpreted as a “weak” effect, from 0.5 to 0.8 — as a “moderate” effect and dC values ≥0.8 as a “strong” effect.

 

Толщина (диаметр) кардиомиоцитов мышей всех возрастных подгрупп линии Bla/J была статистически значимо больше, чем в контрольной группе, причём максимально — в возрасте 6 мес: 35,6 (32,9–37,9)% (95% ДИ); р=8,4×10^–59. Между исследуемыми возрастами животных линии Bla/J статистически значимых различий этого параметра не выявлено.

При оценке периметра ядер кардиомиоцитов, являющегося косвенным признаком синтетической активности клетки, установлено статистически значимое уменьшение этого параметра в подгруппе Bla/J (6 мес) на 23,9 (95% ДИ: 20,2–27,5)% по сравнению с подгруппой Bla/J (3 мес), р=0,04; и на 18,8 (95% ДИ: 8,5–19,7)% по сравнению с контрольной группой, р=8,4×10^–59. Уменьшение периметра ядер с увеличением времени наблюдения за опытной группой описано уравнением линейной регрессии: y=–0,63х+101 (95% ДИ: slope –1,1; –0,2; intercept 98,4; 104,6; р=0,008). Периметр ядер и продолжительность наблюдения за опытной группой имеют линейное соотношение.

При окрашивании железным гематоксилином у мышей линии Bla/J с 3 мес выявлены диффузный межмышечный фиброз миокарда, а также исчезновение поперечной исчерченности у части кардиомиоцитов и разрушение вставочных дисков (рис. 3, a). В контрольной группе (Balb/С) миокард был интактным с параллельно ориентированными кардиомиоцитами, сохранной поперечной исчерченностью, вставочные диски визуализировались, а фиброз отсутствовал (рис. 3, с).

 

Рис. 3. Миокард мышей линии Bla/J (a, b) и Balb/C (c, d): a — 12 мес, межмышечный фиброз; b — 6 мес, множественные фуксинофильные включения в цитоплазме; c — 6 мес, отсутствие признаков фиброза; d — 6 мес, отсутствие фуксинофильных включений в кардиомиоцитах. Окраска железным гематоксилином по Рего (a, c); окраска ГОФПК по Ли (b, d); a, c — ×200; b, d — ×400

Fig. 3. Myocardium of Bla/J (a, b) and Balb/C (c, d) mice: a — 12 months old, intermuscular fibrosis; b — 6 months old, multiple fuchsinophilic insertions in cytoplasm; c — 6 months old, no fibrosis features; d — 6 months old, no fuchsinophilic insertions in cytoplasm. Iron hematoxylin dying (a, c); hematoxylin-basic fuchsin-picric acid dying (b, d); a, c — ×200; b, d — ×400

 

При окрашивании ГОФПК по Ли у мышей линии Bla/J в возрасте 3 мес выявлены гипоксические изменения в виде диффузной фуксинофильной окраски кардиомиоцитов (рис. 3, b). В контрольной группе мышей (Balb/С) в миокарде отсутствовали признаки гипоксического повреждения (рис. 3, d).

При проведении иммунофлуоресцентной реакции с антителами к дисферлину в миокарде мышей линии Bla/J 3-месячного, 6-месячного, 12-месячного возраста белок не выявлен (на рис. 4, a представлены результаты исследования миокарда животных в возрасте 3 мес). У мышей контрольной группы результат был положительным (рис. 4, b), дисферлин представлен в виде включений в саркоплазме и в области вставочных дисков.

 

Рис. 4. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к дисферлину: a — поперечное сечение кардиомиоцитов мышей линии Bla/J; b — продольное сечение кардиомиоцитов мышей линии Balb/C, продукт реакции локализован перинуклеарно в области вставочных дисков (→) и в эндотелиоцитах (*). Свечение в зелёном спектре — аутофлуоресценция белков цитоскелета, свечение в красном спектре — свечение системы детекции, свечение в синем спектре — докраска ядер DAPI; а — ×400; b — ×1000

Fig. 4. Immunofluorescent reaction with dysferlin antynody: a — cross section of Bla/J mice cardiomyocytes; b — axial section Balb/C mice, the product of the reaction has perinuclear localisation and intercalated disks sites (→) and in endothelium (*). Green spectrum fluorescence is auto fluorescence of the cytoskeleton, red spectrum fluorescence is fluorescence of the detection system, blue spectrum fluorescence is nuclear coloring with DAPI; а — ×400; b — ×1000

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В миокарде мышей линии Bla/J наблюдались признаки нарушения структуры ткани с тенденцией к нарастанию патологических изменений от 3 к 12 мес. В контрольной группе (при наличии дисферлина) подобных изменений не выявлено, и это позволяет сделать вывод о том, что отсутствие дисферлина является основным фактором развития патоморфологических изменений миокарда.

Обсуждение основного результата исследования

У животных линии Bla/J состояние миокарда характеризовалось волнообразной деформацией кардиомиоцитов, нарушением параллельной ориентированности кардиомиоцитов и гипоксическим повреждением, чего ранее не наблюдалось в миокарде животных других артифициально полученных линий мышей с дисферлинопатией (линии A/J, C57BL/6J, SJL/J) [23].

Кроме того, установлено исчезновение вставочных дисков у животных с дисферлинопатией и значимое увеличение расстояния между вставочными дисками по сравнению с животными контрольной группы. Сходные изменения, характеризующиеся разрушением до трети вставочных дисков кардиомиоцитов, были показаны ранее в миокарде мышей линии C57BL/6J на «поздних» сроках течения дисферлинопатии [24].

Значимое утолщение кардиомиоцитов у мышей линии Bla/J выявлено во всех возрастных группах. Причиной развития гипертрофии кардиомиоцитов, по всей вероятности, является ремоделирование Т-системы кардимоцитов в виде укорочения Т-трубочек, их аксиальной переориентации и разобщения с саркомерами [15, 25]. Данный патологический процесс ведёт к изменению гомеостаза кальция в кардиомиоцитах, определяющего функционирование сигнального пути кальций-кальмодулин [26, 27]. Гипертрофия миокарда также была описана у дисферлин-дефицитных мышей линии B6.129-Dysf^tm1Kcam/J на 3-м месяце жизни в виде значимого увеличения отношения массы миокарда к массе тела в отличие от группы контроля (масса тела в обеих группах не имела статистически значимых различий). Кроме органного уровня, гипертрофические изменения наблюдались и в изолированных кардиомиоцитах дисферлин-дефицитных мышей в возрасте 3 мес в отличие от группы контрольных животных [28]. Таким образом, при прогрессировании дисферлинопатии у мышей с возрастом развивается гипертрофия кардиомиоцитов.

Межмышечный фиброз у мышей линии Bla/J выявлялся уже на 3-м месяце заболевания, в отличие от дисферлин-дефицитных мышей линии B6.129-Dysf^tm1Kcam/J, у которых фиброз детектировался лишь на 20-м месяце жизни и проявлялся трёхкратным увеличением количества коллагена в строме органа по сравнению с контролем [15, 28]. У мышей линии A/J также не отмечено значимого фиброза [14]. В частности, долевое содержание коллагена нарастало с 2 до 3% в период с 2 до 18 мес наблюдения и не отличалось от контрольной линии мышей A/HeJ [14]. Подобная вариабельность выраженности фиброза миокарда среди различных линий дисферлин-дефицитных мышей требует дальнейших исследований.

Дисферлин в миокарде контрольной линии мышей Balb/C располагался перинуклеарно, в области вставочных дисков и в эндотелиоцитах, что соответствует ранее представленным сведениям [12, 14, 15, 25]. Ряд исследователей также указывают на наличие дисферлина в тубулярной системе кардиомиоцитов и вблизи кальциевых каналов L-типа и рианодиновых рецепторов [12, 25]. В миокарде мышей линии Bla/J дисферлин не выявлен, что является предполагаемой причиной развития каскада патологических изменений в миокарде.

Анализ исследований кардиопатологии у пациентов с поясно-конечностной мышечной дистрофией R2 позволяет провести ряд параллелей с результатами, полученными в нашей работе. В частности, описаны случаи дилатационной кардиомиопатии, характеризовавшиеся гипертрофией кардиомиоцитов в сочетании с увеличением размера ядер, интерстициальным фиброзом или только с вариабельностью размера кардиомиоцитов и дезорганизацией их расположения [29, 30]. Однако диффузный фиброз и жировая инфильтрация миокарда могут быть обнаружены у пациентов с дисферлинопатией даже без клинико-инструментальных признаков кардиомиопатии [16]. Таким образом, в миокарде пациентов с дисферлинопатией могут наблюдаться структурные нарушения, в ряде случаев сопровождающиеся функциональными изменениями [30].

Ограничения исследования. Изучена только одна модель дисферлинопатии — линия Bla/J, что затрудняет экстраполяцию результатов на другие модели.

Кроме того, при планировании и проведении исследования размер выборки для достижения требуемой статистической мощности результатов не рассчитывался. В связи с этим полученная в ходе исследования выборка не может считаться в достаточной степени репрезентативной, что не позволяет экстраполировать полученные результаты и их интерпретацию на генеральную совокупность за пределами исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарушение структуры миокарда у дисферлин-дефицитных мышей линии Bla/J увеличивается с возрастом животных и включает гипертрофию кардиомиоцитов и миокардиальный фиброз. Отсутствие белка дисферлина является ключевым фактором развития патоморфогенеза кардиомиопатий у экспериментальных животных, в частности линии Bla/J.

Вовлечение миокарда в патологический процесс при дисферлинопатии подтверждается выявлением гипертрофии кардиомиоцитов у дисферлин-дефицитных линий мышей и пациентов с поясно-конечностной мышечной дистрофией R2. Вариативность выраженности фиброзных изменений в миокарде различных дисферлин-дефицитных мышей и пациентов ставит под сомнение облигатность данного морфологического признака.

Полученные данные позволяют расширить представления о механизмах развития кардиомиопатии при дисферлинопатии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ, соглашение № 075-15-2021-1346.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: М.А. Савельева — изготовление гистологических препаратов, обзор литературы, подготовка и написание текста статьи; С.Н. Бардаков — статистическая обработка полученных результатов, подготовка и написание текста статьи, редактирование текста; А.М. Емелин — подготовка графических материалов; Р.В. Деев — дизайн исследования, редактирование текста статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The study was carried out with the financial support of the Ministry of Science and Higher Education of Russia, agreement No. 075-15-2021-1346.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. M.A. Savelyeva — production of histological preparations, literature review, writing of the article; S.N. Bardakov — statistical processing of the results, writing and editing the article; A.M. Emelin — preparation of graphic materials; R.V. Deev — research design, editing the text of the article.

Об авторах

Мария Анатольевна Савельева

Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: savelyeva.mariaanat@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0008-5667-115X
SPIN-код: 9935-5416
Россия, Санкт-Петербург

Сергей Николаевич Бардаков

Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова

Email: epistaxis@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3804-6245
SPIN-код: 2351-4096

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Алексей Михайлович Емелин

Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова

Email: eamar40rn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4109-0105
SPIN-код: 5605-1140
Россия, Санкт-Петербург

Роман Вадимович Деев

Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского

Email: romdey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841
SPIN-код: 2957-1687

канд. мед. наук, доцент

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы