Secondary reagents for immunohistochemical research of rat brain

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Специфика иммуногистохимического окрашивания заключается в наглядности получаемых результатов, что делает его одним из незаменимых инструментов исследователя при проведении диагностических и фундаментальных работ. Для получения достоверных и сопоставимых результатов иммуногистохимических исследований критически важны тщательный подбор первичных и вторичных реагентов, а также проведение предварительных тестов, направленных на отработку надёжных протоколов окрашивания [1, 2]. Особое внимание следует уделять выбору вторичных реагентов, которые, как правило, являются основной причиной появления неспецифических ложноположительных результатов [3].

Самыми широко используемыми животными моделями в биомедицинских исследованиях являются грызуны, в частности мыши и крысы [4]. Большинство вторичных реагентов, которые имеются в каталоге производителей, предназначены для работы на материале человека и, как правило, не адаптированы для исследований образцов тканей лабораторных животных, что создаёт дополнительную сложность. Всё это влияет на подбор зачастую дорогостоящих реактивов, а следовательно, значительно удорожает и усложняет проводимые исследования. Особые затруднения для специалистов в этом отношении, ввиду обилия изучаемых маркёров, представляют сложные гетерогенные структуры, такие как головной мозг.

Вместе с тем необходимо отметить, что в связи с реструктуризацией многих фирм по производству антител [5], а также из-за санкций большинство хорошо зарекомендовавших себя реагентов оказались сняты с производства или недоступны для российского исследователя. К примеру, такие высокочувствительные полимерные системы детекции, как EnVision Detection Systems (поставляемые компанией Dako, Дания) и Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System (производимые Spring Bioscience, США), исключены из каталогов компаний Agilent Technologies (США) и Abcam (Великобритания) и в настоящий момент недоступны к приобретению.

Цель настоящей работы — проверка эффективности использования доступных вторичных реагентов, таких как UltraVision Quanto Detection System HRP, N-Histofine Simple Stain MAX PO и UnoVue Rabbit HRP, для иммуногистохимического исследования головного мозга крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили образцы головного мозга крыс линий Вистар (n=2) и SHR (n=2). При работе с животными соблюдали основные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.) и руководствовались Приказом Минздрава России № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» 2016 г. Материал фиксировали с помощью комбинированного фиксатора — цинк-этанол-формальдегида, заливку в парафин осуществляли по стандартной методике. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с парафиновых блоков на ротационном микротоме Rotary 3003 (PFM Medical GmbH, Германия) и наклеивали на стёкла с адгезивным покрытием HistoBond+ (Paul Marienfeld, Германия). Препараты депарафинировали по стандартной методике. Для блокировки активности эндогенной пероксидазы использовали 3% раствор перекиси водорода.

Для постановки иммуногистохимических реакций применяли следующие первичные реагенты:

• кроличьи моноклональные антитела к белку промежуточных филаментов виментину (Vim) (HUABIO, Китай) в разведении 1:500 для выявления эпендимных клеток;
• кроличьи поликлональные антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (glial fibrillary acidic protein, GFAP) (Agilent Technologies, США) в разведении 1:500 для выявления астроцитов;
• кроличьи моноклональные антитела к кальций-связывающему белку Iba-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1) (HUABIO, Китай) в разведении 1:900 для выявления микроглии.

Перечисленные белки являются общеизвестными высокоселективными маркёрами различных популяций глиальных клеток, которые широко применяются в нейробиологических исследованиях [6–8].

Для инкубации первичных антител препараты оставляли на ночь в термостате при температуре 35° С. Разведение первичных реагентов и режим инкубации были выбраны на основании рекомендаций производителя по интервалам разведения и инкубации, а также по аналогии с ранее апробированными протоколами [9–11].

В качестве вторичных антител применяли реагенты из наборов UnoVue Rabbit HRP (Diagnostic BioSystems, США), N-Histofine Simple Stain MAX PO Universal Immuno-peroxidase Polymer anti-rabbit (Nicherei Biosciences Inc., Япония) и набор UltraVision Quanto Detection System HRP (Thermo Fisher Scientific, США). Для блокировки неспецифического связывания вторичных антител в реагент primary antibody amplifier из набора UltraVision Quanto Detection System HRP добавляли нормальную крысиную сыворотку до конечной концентрации раствора 0,5%. Инкубацию вторичных антител проводили при температуре 27,5° С, время соответствует рекомендациям производителей. Визуализацию продуктов реакции осуществляли с помощью хромогена 3,3'-диаминобензидина (DAB+; Agilent Technologies, США), приготовленного в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве заключающей среды использовали Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Полученные микропрепараты анализировали с помощью светового микроскопа Leica DM750 с объективами HI PLAN 40×/0,65 и 100×/1,25 (Leica Microsystems, Германия). Для съёмки изображений использовали цифровую камеру Leica ICC50 и компьютерную программу LAS EZ (Leica Microsystems, Германия). Подготовку коллажа проводили в программе Adobe Photoshop CC 2018 (Adobe, США).

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/22 от 06.04.2022).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате иммуногистохимической реакции с использованием всех трёх первичных антител и последующим применением системы визуализации UltraVision Quanto Detection System HRP на препаратах головного мозга крысы чётко выявлялись тела и отростки иммунопозитивных клеток (рис. 1, a–c, стрелки). Фоновое окрашивание отсутствовало. Микроглиальные клетки располагались на срезах головного мозга повсеместно, преобладали клетки с типичной отростчатой формой. Ядро клеток микроглии часто сложно просматривалось вследствие интенсивной реакции на белок в перинуклеарной цитоплазме. Многочисленные тонкие отростки клеток, содержащих Iba-1, были хорошо различимы благодаря интенсивной окраске. Положительную реакцию на GFAP в головном мозге давали астроциты, локализованные в белом и сером веществе. На препаратах видны многочисленные GFAP-позитивные отростки, попавшие в плоскость среза. Место локализации ядра хорошо просматривалось. Виментин-содержащие элементы головного мозга крысы наблюдались в клетках выстилки желудочков, менингоцитах мягкой мозговой оболочки, в эндотелиоцитах и других клетках кровеносных сосудов (гладкие миоциты и клетки адвентиции). Отмечено наличие виментин-иммунопозитивных внеэпендимных клеток (рис. 1, c, двойная стрелка). Они располагались в нейропиле вблизи поверхности желудочков.

Рис. 1. Выявление глиальных клеток головного мозга крысы с применением разных вариантов вторичных реагентов. Иммуногистохимическая реакция на Iba-1 (a, d, g), GFAP (b, e, h) и виментин (c, f, i); a–c — выявление клеток с использованием реагентов из набора UltraVision Quanto Detection System HRP; d–f — с применением набора UnoVue Rabbit HRP; g–i — с применением набора N-Histofine Simple Stain MAX PO. Стрелки указывают на глиоциты, двойные стрелки — на внеэпендимные эпендимоциты, головки стрелок — неспецифическая реакция, звёздочки — полость желудочка. Объективы: HI PLAN 100×/1.25 OIL (масляная иммерсия) (a, b, d, e, g, h) и HI PLAN 40×/0.65 (c, f, i) (Leica Microsystems, Германия)

Fig. 1. Detection of glial cells in rat brain using various secondary antibodies. Iba-1 (a, d, g), GFAP (b, e, h) and vimentin (c, f, i) immunohistochemistry; a–c — visualisation with UltraVision Quanto Detection System HRP; d–f — visualisation with UnoVue Rabbit HRP; g–i — visualisation with N-Histofine Simple stain MAX PO. Arrows mark glial cells, double arrows show extraependymal ependymocytes, arrowheads — non-specific binding, asterisk — brain ventricle. HI PLAN 100x/1.25 OIL (oil immersion) (a, b, d, e, g, h) and HI PLAN 40x/0.65 (c, f, i) lens (Leica Microsystems, Germany)

Использование вторичных реагентов UnoVue Rabbit HRP также позволило иммуноспецифично, с минимальным фоновым окрашиванием, выявить глиальные элементы головного мозга крысы. Их распределение, как и в предыдущем исследованном случае, соответствовало общим представлениям о локализации структур головного мозга, содержащих Iba-1, GFAP и виментин. Недостатком данных вторичных антител является более слабая по сравнению с UltraVision Quanto Detection System HRP интенсивность иммуногистохимической реакции при одинаковых условиях инкубации и разведения первичных антител. В частности, тонкие отростки микроглиоцитов почти не проявляются в этом варианте методики (рис. 1, d). Хорошо различимы только крупные или недалеко отстоящие от сомы отростки. Меньше различимы и GFAP-позитивные поперечно-перерезанные отростки. Достаточно высокой интенсивностью иммунореакции отличались срезы, окрашенные на виментин (рис. 1, f). Тем не менее внеэпендимные клетки, содержащие виментин, с помощью системы детекции UnoVue Rabbit HRP выявлялись слабо и были малоконтрастными.

Неудовлетворительные результаты получены при использовании системы N-Histofine Simple Stain MAX PO. Несмотря на высокую интенсивность реакции, вторичные антитела характеризовались высоким уровнем неспецифического связывания, который мог экранировать структуры, содержащие искомые антигены (рис. 1, g–i, головки стрелок). Неспецифическая реакция маркировала цитоплазму и ядерный гетерохроматин клеток и придавала слабую окраску нейропилю.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование меченых вторичных антител, соответствующих первичным, справедливо считается более чувствительным методом визуализации по сравнению с прямым методом Кунса благодаря возможности связи нескольких антител антиглобулиновой сыворотки с разными сайтами первичного антитела. Таким образом, этот подход, с одной стороны, увеличивает амплификацию сигнала, а с другой — обеспечивает универсальность иммуногистохимического подхода, поскольку одну и ту же антисыворотку можно использовать с различными первичными антителами, полученными от одного и того же вида животных. В ходе развития методологии непрямой метод претерпел множество модификаций, к которым относятся широко применяемые авидин-биотиновые, пероксидаза-антипероксидазные и полимерные системы амплификации сигнала [12, 13].

Исследуемые в данной работе методические подходы основаны на использовании первичных кроличьих (поли- и моноклональных) антител и полимерных систем визуализации антигена. Эта технология предполагает применение полимерной макромолекулярной основы (например, декстрана), конъюгированной с несколькими молекулами вторичных антител и фермента (в настоящей работе — пероксидазой хрена) [12]. Выбор таких первичных реагентов обусловлен в первую очередь тем, что дальнейшее применение антикроличьих вторичных антител для визуализации белка интереса не предполагает возникновения перекрёстных неспецифических реакций. Хорошо известно, что мыши и крысы филогенетически близки, а их иммуноглобулины иммунологически родственны [14]. Поэтому выявление мышиных первичных антител в образцах тканей крысы было бы дополнительно осложнено необходимостью блокирования перекрёстной активности. Чтобы избежать такого неспецифического окрашивания, было решено применить первичные антитела, позволяющие использовать вторичные реагенты, не направленные против иммуноглобулинов мыши или крысы.

При этом необходимо отдельно упомянуть, что используемая в настоящей работе система UltraVision Quanto Detection System HRP является поливалентной, т.е. имеет двойную иммунную активность. Поэтому с учётом конъюгации в указанном наборе вторичных антимышиных и антикроличьих антител нами была предпринята модификация вторичных реагентов, заключающаяся в добавлении в раствор антител нормальной крысиной сыворотки. Как показал анализ препаратов, процедура модификации вторичных реагентов не только не привела к потере чувствительности иммуногистохимической реакции, но и обеспечила наилучшее среди исследуемых реагентов соотношение интенсивности сигнала к уровню фона.

Оптимальное соотношение уровней сигнал/фон также отмечено при анализе препаратов, обработанных с помощью системы UnoVue Rabbit HRP. Однако данный вариант исследуемых вторичных реагентов показал меньшую амплификацию сигнала по сравнению с UltraVision Quanto Detection System HRP. В первую очередь это связано с тем, что в настоящей работе применяли единый протокол обработки препаратов для удобства стандартизации полученных результатов. Поэтому предполагается, что изменение условий инкубации, демаскирования антигена или разведения первичных антител может позволить повысить чувствительность реакции и добиться сходных результатов. В частности, отмечено, что на препаратах, обрабатываемых UnoVue Rabbit HRP, после инкубации с антисывороткой к виментину, как и при обработке UltraVision Quanto Detection System HRP, присутствуют иммунопозитивные клетки, имеющие структурное сходство с типичными клетками эпендимы, но располагающиеся вне эпендимного слоя. Наличие этих клеток на препаратах не является артефактом и показано для нескольких близлежащих к третьему и боковым желудочкам зон головного мозга [15]. На препаратах головного мозга, полученных при применении UnoVue Rabbit HRP, эти клетки имели более слабую иммунореактивность на виментин по сравнению с клетками эпендимы, что косвенно указывает на сниженную концентрацию антигена. В таких случаях добиться хороших результатов позволяет увеличение продолжительности инкубации срезов с первичными антителами до нескольких суток [16]. Поэтому стоит подчеркнуть, что обе обозначенные выше системы вторичных реагентов характеризуются высокой эффективностью для проведения исследований с использованием крыс.

Неспецифическая реакция, отмеченная при использовании вторичных реагентов N-Histofine Simple Stain MAX PO, может дать ложное впечатление о характере распределения белка в условиях отсутствия чёткого понимания, где именно экспрессирован антиген. Например, в новаторских исследованиях экспрессии [17] или при моделировании экспериментальной патологии [18] использование реагентов типа N-Histofine Simple Stain MAX PO будет сопряжено с высоким риском получения ложноположительных результатов. Это должно учитываться при проведении экспериментальных исследований и разработке методологии исследования.

Однако проявление фонового окрашивания при применении этого реактива не стало неожиданным результатом. Как утверждается в аннотации производителя (https://clck.ru/3A2G7w), N-Histofine Simple Stain MAX PO разработан специально для иммуногистохимического окрашивания срезов тканей человека. Поэтому аффинная абсорбция вторичных антител, направленная на исключение фонового окрашивания, проводилась, по-видимому, только с помощью человеческой, а не крысиной или мышиной сыворотки. Отсутствие этапа очистки с применением крысиной сыворотки и стало причиной неспецифического окрашивания клеток и нейропиля. Вероятно, аналогичная модификация, которая выполнялась для набора UltraVision Quanto Detection System HRP, может и в этом случае привести к снижению уровня фона. Известно также, что вторичные реагенты, которые предназначены для работы с тканями человека, могут оказаться подходящими и для иммуногистохимического исследования тканей лабораторных животных. Так, научная группа под руководством M. Pervin [19] (исследование выполнено с помощью реагентов из набора N-Histofine Simple Stain MAX PO) продемонстрировала удовлетворительные результаты иммуногистохимического выявления резидентных макрофагов печени крыс (клеток Купфера). Нами было решено проверить работу этого набора на тканях головного мозга крыс. Однако представленные препараты оказались примером того, как нецелевое использование набора приводит к неудовлетворительному результату, что является одной из возможных ошибок при планировании и проведении иммуногистохимического исследования [20]. Поэтому важно, чтобы специалисты понимали состав и этапы производства предоставляемого реактива. Это часто оказывается невозможным для продуктов, защищённых патентным правом или коммерческой тайной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Опробованные в настоящем исследовании наборы вторичных реагентов UnoVue Rabbit HRP и UltraVision Quanto Detection System HRP оказались сходными по степени специфичности результатов. Однако полимерная система UnoVue Rabbit HRP обладает более слабой интенсивностью реакции, что необходимо учитывать при разведении первичных антител и разработке режимов инкубации. Окрашивающий реактив N-Histofine Simple Stain MAX PO, предназначенный для работ с образцами ткани человека, является непригодным для исследования срезов мозга лабораторных животных.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: В.А. Разенкова — концепция исследования, сбор и анализ литературных данных, написание и редактирование текста статьи; В.С. Павлова — изготовление препаратов, проведение иммуногистохимических реакций, анализ материала, написание текста статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The work was carried out within the framework of the state assignment of the Institute of Experimental Medicine.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. V.A. Razenkova — idea of the study, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; V.S. Pavlova — preparation of histological slides, carrying out immunohistochemical reactions, analysis of material, writing the article.

About the authors

Valeria A. Razenkova

Author for correspondence.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-code: 8877-8902
Russian Federation, Saint Petersburg

Valeria S. Pavlova

Email: herondale.valery@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-8434-0498
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Detection of glial cells in rat brain using various secondary antibodies. Iba-1 (a, d, g), GFAP (b, e, h) and vimentin (c, f, i) immunohistochemistry; a–c — visualisation with UltraVision Quanto Detection System HRP; d–f — visualisation with UnoVue Rabbit HRP; g–i — visualisation with N-Histofine Simple stain MAX PO. Arrows mark glial cells, double arrows show extraependymal ependymocytes, arrowheads — non-specific binding, asterisk — brain ventricle. HI PLAN 100x/1.25 OIL (oil immersion) (a, b, d, e, g, h) and HI PLAN 40x/0.65 (c, f, i) lens (Leica Microsystems, Germany)

Download (2MB)

Indexing metadata