Secondary reagents for immunohistochemical research of rat brain

Full Text

Обоснование

Специфика иммуногистохимического метода заключается в наглядности получаемых результатов, что делает его одним из незаменимых инструментов исследователя при проведении диагностических и фундаментальных работ. Для получения достоверных и сопоставимых результатов критически важным при выполнении иммуногистохимических исследований является тщательный подбор первичных и вторичных реагентов, а также проведение предварительных тестов, направленных на отработку надежных протоколов окрашивания [1, 2]. Особое внимание следует уделять выбору вторичных реагентов, которые, как правило, являются основной причиной появления неспецифических ложноположительных результатов [3]. Наряду с этим, самыми широко используемыми животными-моделями в биомедицинских исследованиях являются грызуны, в частности, мыши и крысы [4]. Дополнительную сложность в этом отношении составляет то, что большинство вторичных реагентов, которые имеются в каталоге у производителей, предназначены для работы на материале человека и, как правило, не адаптированы для исследований образцов тканей лабораторных животных. Все это влияет на подбор зачастую дорогостоящих реактивов, а, следовательно, значительно удорожает и усложняет проводимые исследования. Особые затруднения для специалистов в этом отношении, ввиду обилия изучаемых маркеров, представляют сложные гетерогенные структуры, такие как головной мозг.

Вместе с тем необходимо отметить, что в связи с реструктуризацией многих фирм по производству антител (https://clck.ru/393vSe) [5], а также санкций, большая часть хорошо зарекомендовавших себя реагентов оказалась снята с производства или недоступна для российского исследователя. К примеру, такие высокочувствительные полимерные системы детекции как EnVision™+ Detection Systems, (поставляемые компанией Dako) и Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System (производимые Spring Bioscience, Inc.) исключены из каталогов компаний Agilent Technologies (США) и Abcam (Великобритания), и в настоящий момент недоступны к приобретению.

Цель

В связи с этим, цель настоящей работы состояла в проверке эффективности использования доступных вторичных реагентов, таких как UltraVision Quanto, N-Histofine Simple stain MAX PO ® и UnoVue Rabbit HRP, для иммуногистохимического исследования головного мозга крысы.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Материалом для исследования служили образцы головного мозга крыс породы Wistar (n=2) и линии SHR (n=2). При работе с животными соблюдали основные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.) и «Правила надлежащей лабораторной практики» (приказ №199н от 01.04.2016 г. Минздрава России).  Материал фиксировали с помощью комбинированного фиксатора цинк-этанол-формальдегид, заливку в парафин осуществляли по стандартной методике. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с парафиновых блоков на ротационном микротоме Rotary 3003 PFM Medical (PFM Medical, Германия) и наклеивали на стекла с адгезивным покрытием HistoBond+ (Paul Marienfeld, Германия). Препараты депарафинировали по стандартной методике. Для блокировки активности эндогенной пероксидазы использовали 3% раствор перекиси водорода.

Для постановки иммуногистохимических реакций использовали следующие первичные реагенты:

• Кроличьи моноклональные антитела к белку промежуточных филаментов виментину (Vim) (Huabio, КНР) в разведении 1:500 для выявления эпендимных клеток,
• Кроличьи поликлональные антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (glial fibrillary acidic protein, GFAP) (Agilent, США) в разведении 1:500 для выявления астроцитов,
• Кроличьи моноклональные антитела к кальций-связывающему белку Iba-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1) (Huabio, КНР) в разведении 1:900 для выявления микроглии.

Для инкубации первичных антител препараты оставляли на ночь в термостате при температуре 35° С. В качестве вторичных антител применяли реагенты из наборов UnoVue Rabbit HRP (Diagnostic BioSystems, США), N-Histofine® Simple Stain MAX PO Universal Immuno-peroxidase Polymer anti-rabbit (Nicherei Biosciences, Inc., Япония) и набор UltraVision Quanto Detection System HRP (Thermo Fisher Scientific, США). Для блокировки неспецифического связывания вторичных антител в реагент Primary antibody amplifier из набора UltraVision Quanto Detection System HRP добавляли нормальную крысиную сыворотку до конечной концентрации раствора 0,5%. Инкубацию вторичных антител проводили при температуре 27,5° С, время соответствует рекомендациям производителей. Визуализацию продуктов реакции осуществляли с помощью хромогена 3,3 диаминобензидина (DAB+, Agilent, США), приготовленного в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве заключающей среды использовали Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, Германия). Полученные микропрепараты анализировали с помощью светового микроскопа Leica DM750 с объективами HI PLAN 40x/0,65 и 100x/1,25 (Leica Microsystems, Германия). Для анализа и обработки изображений использовали компьютерную программу LAS EZ (Leica Microsystems, Германия) и Adobe Photoshop CC 2018 (Adobe, США).

Этическая экспертиза

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол No 2/22 от 06.04.2022).

Результаты

В результате иммуногистохимической реакции с использованием всех трех первичных антител и последующим применением системы визуализации UltraVision Quanto Detection System HRP на препаратах головного мозга крысы четко выявлялись тела и отростки иммунопозитивных клеток (рис. 1a-c, стрелки). Фоновое окрашивание отсутствует. Микроглиальные клетки располагались на срезах головного мозга повсеместно, преобладали клетки с типичной отростчатой формой. Ядро клеток микроглии часто сложно просматривалось вследствие интенсивной реакции на белок в перинуклеарной цитоплазме. Многочисленные тонкие отростки Iba-1-содержащих клеток хорошо различимы благодаря интенсивной окраске. Положительную реакцию на GFAP в головном мозге давали астроциты, локализованные в белом и сером веществе. На препаратах видны многочисленные GFAP-позитивные отростки, попавшие в плоскость среза. Место локализации ядра хорошо просматривалось. Виментин-содержащие элементы головного мозга крысы наблюдали в клетках выстилки желудочков, менингоцитах мягкой мозговой оболочки, в эндотелиоцитах и других клетках кровеносных сосудов (гладкие миоциты и клетки адвентиции). Отмечено наличие виментин-иммунопозитивных внеэпендимных клеток (рис. 1c, двойная стрелка). Они располагались в нейропиле вблизи поверхности желудочков.

Использование вторичных реагентов UnoVue Rabbit HRP также позволило иммуноспецифично, с минимальным фоновым окрашиванием, выявить глиальные элементы головного мозга крысы. Их распределение, как и в предыдущем исследованном случае, соответствовало общим представлениям о локализации структур головного мозга, содержащих Iba-1, GFAP и виментин. Недостатком данных вторичных антител является более слабая, по сравнению с Quanto Detection System HRP, интенсивность ИГХ реакции при одинаковых условиях инкубации и разведения первичных антител. В частности, тонкие отростки микроглиоцитов почти не проявляются в этом варианте методики (как можно увидеть на рис. 1d). Хорошо различимы только крупные отростки, или отростки, недалеко отстоящие от сомы. Меньше различимы и GFAP-позитивные поперечноперерезанные отростки. Достаточно высокой интенсивностью иммунореакции отличались срезы, окрашенные на виментин (рис. 1f). Тем не менее, внеэпендимные клетки, содержащие виментин, с помощью системы детекции UnoVue Rabbit HRP выявлялись слабо и были малоконтрастны.

Неудовлетворительные результаты были получены при использовании системы N-Histofine® Simple Stain MAX PO. Несмотря на высокую интенсивность реакции, вторичные антитела характеризовались высоким уровнем неспецифического связывания, который мог экранировать структуры, содержащие искомые антигены (рис. 1g-i, головки стрелок). Несцецифическая реакция маркировала цитоплазму и ядерный гетерохроматин клеток и придавала слабую окраску нейропилю.

Обсуждение

Использование меченых вторичных антител, соответствующих первичным, справедливо считается более чувствительным методом визуализации по сравнению с прямым методом Кунса, благодаря возможности связи нескольких антител антиглобулиновой сыворотки с разными сайтами первичного антитела. Таким образом, этот подход, с одной стороны увеличивает амплификацию сигнала, а с другой – обеспечивает универсальность иммуногистохимического подхода, поскольку одну и ту же антисыворотку можно использовать с различными первичными антителами, полученными от одного и того же вида животных. В ходе развития методологии непрямой метод претерпел множество модификаций, к которым относятся широко применяемые авидин-биотиновые, пероксидаза-антипероксидазные и полимерные системы амплификации сигнала [6, 7].

Исследуемые в данной работе методические подходы основаны на использовании первичных кроличьих (поли- и моноклональных) антител и полимерных систем визуализации антигена. Эта технология предполагает использование полимерной макромолекулярной основы (например, декстрана), конъюгированной с несколькими молекулами вторичных антител и фермента (в настоящей работе – пероксидазой хрена) [6]. Выбор таких первичных реагентов обусловлен в первую очередь тем, что дальнейшее применение антикроличьих вторичных антител для визуализации белка интереса не предполагает возникновение перекрестных неспецифических реакций. Хорошо известно, что мыши и крысы филогенетически близки, а их иммуноглобулины иммунологически родственны [8]. Поэтому, выявление мышиных первичных антител в образцах тканей крысы было бы дополнительно осложнено необходимостью блокирования перекрестной активности. Чтобы избежать такого неспецифического окрашивания, было решено использовать первичные антитела, позволяющие использовать вторичные реагенты, не направленные против иммуноглобулинов мыши или крысы.

При этом необходимо отдельно упомянуть, что используемая в настоящей работе система Quanto Detection System HRP является поливалентой, то есть, имеет двойную иммунную активность. Поэтому, принимая во внимание конъюгацию в указанном наборе вторичных антимышиных и антикроличьих антител, нами была предпринята модификация вторичных реагентов, заключающаяся в добавлении в раствор антител нормальной крысиной сыворотки. Как показал анализ препаратов, процедура модификации вторичных реагентов не только не привела к потере чувствительности ИГХ реакции, но и обеспечила наилучшее среди исследуемых реагентов соотношение интенсивности сигнала к уровню фона.

Оптимальное соотношение уровней сигнал/фон также отмечено при анализе препаратов, обработанных с помощью системы UnoVue Rabbit HRP. Однако, этот вариант исследуемых вторичных реагентов показал меньшую амплификацию сигнала по сравнению с Quanto Detection System HRP. В первую очередь это связано с тем, что в настоящей работе применяли единый протокол обработки препаратов – для удобства стандартизации полученных результатов. Поэтому предполагается, что изменение условий инкубации, демаскирования антигена или разведения первичных антител, может позволить чувствительность реакции и добиться сходных результатов. В частности, отмечено, что на препаратах, обрабатываемых UnoVue Rabbit HRP после инкубации с антисывороткой к виментину, также, как и при обработке Quanto Detection System HRP, присутствуют иммунопозитивные клетки, имеющие структурное сходство с типичными клетками эпендимы, но располагающиеся вне эпендимного слоя. Наличие этих клеток на препаратах не является артефактом, и показано для нескольких близлежащих к III и боковым желудочкам зон головного мозга [9]. На препаратах головного мозга, полученных при применении UnoVue Rabbit HRP, эти клетки имели более слабую иммунореактивность на виментин по сравнению с клетками эпендимы, что косвенно указывает на сниженную концентрацию антигена. В таких случаях хороших результатов позволяет добиться увеличение продолжительности инкубации срезов с первичными антителами до нескольких суток [10]. Поэтому стоит подчеркнуть, что обе вышеобозначенные системы вторичных реагентов характеризуются высокой эффективностью для проведения исследований с использованием крыс.

Неспецифическая реакция, отмеченная при использовании вторичных реагентов N-Histofine® Simple Stain MAX PO, может дать ложное впечатление о характере распределения белка в условиях отсутствия четкого понимания, где именно экспрессирован антиген. Например, при проведении новаторских исследований экспресии [11] или моделировании экспериментальной патологии [12] использование реагентов типа N-Histofine® Simple Stain MAX PO будет сопряжено с высоким риском получения ложноположительных результатов. Это должно учитываться при проведении экспериментальных исследований и разработке методологии исследования.

Однако, проявление фонового окрашивания при применении этого реактива не стало неожиданным результатом. Как утверждается в аннотации производителя, N-Histofine® Simple Stain MAX PO разработан специально для иммуногистохимического окрашивания срезов тканей человека. Поэтому, аффинная абсорбция вторичных антител, направленная на исключение фонового окрашивания, проводилась, по-видимому, только с помощью человеческой, а не крысиной или мышиной, сыворотки. Отсутствие этапа очистки с применением крысиной сыворотки и стала причиной неспецифического окрашивания клеток и нейропиля. Вероятно, аналогичная модификация, которая проводилась для набора Quanto Detection System HRP, может и в этом случае привести к снижению уровня фона. Представленные препараты оказались примером того, как нецелевое использование набора приводит к неудовлетворительному результату, что является одной из возможных ошибок при планировании и проведении иммуногистохимического исследования [13]. Поэтому важно, чтобы специалисты понимали состав и этапы производства предоставляемого реактива, что часто оказывается невозможно для продуктов, защищенных патентным правом или коммерческой тайной.

Заключение

Опробованные в настоящем исследовании наборы вторичных реагентов UnoVue Rabbit HRP и Quanto Detection System HRP оказались сходны по степени специфичности результатов. Однако, полимерная система UnoVue Rabbit HRP обладает более слабой интенсивностью реакции, что необходимо учитывать при разведении первичных антител и разработке режимов инкубации. Окрашивающий реактив N-Histofine® Simple Stain MAX PO, предназначенный для работ с образцами ткани человека, является непригодным для исследования срезов мозга лабораторных животных.

About the authors

Valeria A. Razenkova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-code: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

младший научный сотрудник отдела Общей и частной морфологии

Russian Federation, Saint Petersburg

Valeria S. Pavlova

Institute of Experimental Medicine

Email: herondale.valery@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-8434-0498

лаборант-исследователь лаборатории экспериментальной гистологии и конфокальной микроскопии Отдела общей и частной морфологии

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files