CONNEXIN-43 IN CELLS OF INJURED RAT SCIATIC NERVE

Full Text

Повреждения периферических нервов, ганглиев и спинномозговых корешков являются распространенной клинической проблемой [1, 2]. Такие нарушения периферической нервной системы (ПНС) характеризуются органическими или механическими повреждениями различной локализации вследствие травм, нейродегенеративных, аутоиммунных, инфекционных, токсических и прочих воздействий. Механические повреждения периферических нервных проводников являются одним из наиболее распространенных и тяжелых видов травм, приводящих к полной или частичной утрате двигательных, сенсорных и вегетативных функций, хроническим нейропатическим болям, инвалидизации и снижению качества жизни. Несмотря на то, что органы ПНС, в частности нервные проводники, обладают значительным регенеративным потенциалом, клинический эффект терапии таких повреждений часто бывает неудовлетворительным. Это связано с тем, что точные молекулярно-клеточные механизмы, регулирующие процессы регенерации нерва после травмы, не вполне ясны. Очевидно, что регенерация нервов обеспечивается точной координацией взаимодействий различных клеточных популяций и сложными молекулярными процессами, приводящими в конечном итоге к возобновлению роста аксонов, восстановлению иннервации тканей и органов. Детальное исследование механизмов взаимного влияния глиальных, нейрональных и иммунных клеток, участвующих в процессах дегенерации и регенерации нервов может способствовать усовершенствованию терапевтических стратегий при травмах ПНС. Известно, что межклеточные коммуникации в ПНС обеспечивают адгезионные, замыкающие (простые и плотные), а также проводящие, в частности, щелевые контакты. Последний тип клеточных контактов обеспечивают каналы, сформированные белками коннексинами. В литературе присутствуют данные об изменении экспрессии коннексина 32 [3, 4, 5], коннексина 46 [3] и других типов коннексинов [6] при травме нерва. Однако крайне мало исследований описывают изменение экспрессии коннексин-43 при аналогичной патологии [3, 4].

Цель настоящего исследования состояла в изучении распределения и локализации белка щелевых контактов коннексина-43 (Сx43) в клетках седалищного нерва крысы в норме и после повреждения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на крысах-самцах Вистар (n=10). Повреждение седалищных нервов крыс подопытной группы (n=5) было проведено путем наложения лигатуры в течение 40 с. В качестве группы контроля исследованы животные без повреждения седалищного нерва (n=5). Все манипуляции с животными были выполнены, следуя «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» и с соблюдением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (1986 г.). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 4/22 от 29.09.2022). У подопытных крыс на уровне верхней трети бедра удаляли шерсть и выполняли разрез размером 1–1,5 см, подлежащую мышцу также рассекали. Открытый седалищный нерв иммобилизовали с использованием стерильной стеклянной палочки и накладывали лигатуру на 40 сек. Рассеченную мышцу и кожу зашивали. Все использованные животные содержались в стандартных условиях вивария с неограниченным доступом к воде и пище. На 7 сутки после наложения лигатуры у подопытных животных выделяли сегменты нерва размером 1-1,5 см в области наложения лигатуры с прилежащим дистальным участком нерва. Также в ходе исследования получены аналогичные фрагменты интактного седалищного нерва у животных группы контроля. Весь гистологический материал фиксировали в течение суток в растворе цинк-этанол-формальдегида, обезвоживали в абсолютном этаноле, смеси абсолютного спирта и ксилола, помещали в ксилол и смесь ксилола с парафином (37 °C). Далее весь гистологический материал заливали в парафин. С применением ротационного микротома было изготовлено необходимое количество парафиновых срезов (5 мкм) исследуемого материала, полученного от подопытных и контрольных животных. Далее срезы обеспарафинивали и регидратировали. Производили демаскирование антигена в течение 25 мин при 99.5°С в предварительно разогретом 10%-ном водном растворе тиосульфата натрия. Для блокировки неспецифического связывания на гистологические срезы наносили Protein block (Spring Bioscience, США). Иммуногистохимическую реакцию на коннексин-43 (Cx43) проводили с применением моноклональных мышиных антител (sc-271837, клон F-7, разведение 1 : 600, Santа Cruze Biotechnology, США). Время инкубации с первичными антителами составило 24 ч при температуре 27°С. В качестве вторичных реагентов использовали набор UltraVision Quanto Detection System HRP (TL-060-QH; Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением нормальной крысиной сыворотки (ФГБНУ «ИЭМ»). Продукт иммуногистохимической реакций выявляли с помощью 3'3-диаминобензидина (DAB+, Dako, Дания), часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином Карацци (Биовитрум, Россия) или астровым синим. Препараты анализировали с применением светового микроскопа Leica DM750 (Leica,Германия) и камеры ICC50 (Leica, Германия). Анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения LAS EZ (Leica, Германия).

Для оценки специфичности реакции на коннексин-43 проводили постановку отрицательного и положительного иммуногистохимического контроля. При отрицательном иммуногистохимическом контроле исключали инкубацию с первичными антителами, вместо них на гистологические срезы наносили разбавитель S0809 (Dako, Дания). Для положительного иммуногистохимического контроля использовали архивные срезы спинного мозга взрослых крыс.

Не было обнаружено зон иммунореактивности на срезах спинного мозга крыс при проведении отрицательного иммуногистохимического контроля. При постановке положительного контроля в сером веществе спинного мозга взрослых животных, а также в области пограничной глиальной мембраны идентифицируется точечные коннексин-43-содержащие структуры в клетках астроглии. Интенсивное точечное окрашивание присутствует также в клетках оболочек спинного мозга, точечные иммунопозитичные структуры выявляются в эпендиме. Результаты положительного и отрицательного иммуногистохимического контроля свидетельствуют о высокой специфичности подобранных протоколов проведения иммуногистохимической реакции на коннексин-43.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При окрашивании гистологических срезов интактного седалищного нерва крысы гематоксилином и эозином четко идентифицируются эндо-, пери- и эпиневральная оболочки (рис.1, а). В составе эпиневрия присутствуют рыхлая соединительная ткань, кровеносные сосуды, и небольшие участки жировой ткани. Периневральная оболочка образована несколькими слоями плоских периневральных клеток с уплощенными вытянутыми ядрами. Эндоневрий содержит группы нервных волокон, окруженных шванновскими клетками (нейролеммоцитами). Кроме того, в эндоневрии интактного нерва присутствуют единичные тучные клетки, макрофаги и фибробласты. Сосуды, расположенные в толще эндоневрия, немногочисленны и имеют малый диаметр.

В настоящем исследовании отмечено, что коннексин-43 в интактном седалищном нерве крыс присутствует главным образом в клетках эпиневрия и периневрия (рис.1, b). Белок выявляется в виде точечных иммунопозитивных структур в клетках жировой ткани и эндотелиоцитов сосудов эпиневрия. В периневральных клетках кроме точечных коннексин-43-иммунопозитивных структур также отмечается диффузное окрашивание цитоплазмы клеток. Нами отмечено, что в области эндоневральной оболочки интактного седалищного нерва иммунореактивность проявляют лишь эндотелиоциты немногочисленных капилляров, в других областях эндоневрия белок не идентифицируется (рис.2, а).

Через 7 сут после повреждения в дистальном сегменте активно протекают процессы валлеровской дегенерации. При морфологическом исследовании дистального сегмента поврежденного седалищного нерва крысы наблюдается увеличение количества кровеносных сосудов, их диаметр возрастает. Также в области эндоневрия отмечается присутствие макрофагов и продуктов распада миелина. С целью оценки распределения белка коннексина-43 в поврежденном нерве была проведена иммуногистохимическая реакция. Установлено, что локализация белка в области эпиневральной и периневральной оболочек соответствует интактному нерву. Коннексин-43 сохраняет точечное распределение в клетках эндотелия сосудов, клетках периневрия и жировой ткани. В отличие от интактного нерва в эндоневрии поврежденного нерва между регенерирующими и гибнущими нервными волокнами присутствует большое количество коннексин-43-иммунопозитивных клеток (рис.2, b). Они представляют собой клетки веретеновидной, овальной или неправильной формы, с интенсивной точечной окраской цитоплазмы, обладающие тонкими ветвящимися отростками, ориентированными, как правило, вдоль нервных волокон. Ядра таких клеток имеют округлую или овальную форму. Нередко такие клетки располагаются в непосредственной близости к сосудам эндоневрия (рис.2, c, d).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе было проведено иммуногистохимическое исследование коннексин-43-содержащих клеток в интактном и поврежденном седалищном нерве крыс. Установлено, что в интактном нерве коннексин-43 -содержащие структуры присутствуют в клетках периневрия, клетках стенок кровеносных сосудов и в клетках жировой ткани эпиневральной оболочки седалищного нерва. В области эндоневрия коннексин-43 определяется лишь в эндотелиоцитах немногочисленных сосудов Эти результаты согласуются с ранее представленными данными [3]. На 7 сутки после наложения лигатуры распределение коннексина-43 в структурах периневрия и эпиневрия соответствует интактному нерву. В эндоневрии поврежденного нерва в отличие от контроля встречаются коннексин-43-иммунопозитивные клетки. Они представляют собой крупные клетки неправильной формы с округлыми или овальными светлыми ядрами и большим объемом цитоплазмы. Отличительной особенностью этих клеток является наличие длинных разветвленных отростков. Тканевая принадлежность этих клеток неясна.

Примечателен тот факт, что в выявленных нами клетках эндоневрия коннексин-43 локализуется не только в области цитоплазматической мембраны в виде точечных структур, представляющих собой бляшки щелевого контакта [7], но также обнаруживается в цитоплазме данных клеток. Основная общеизвестная функция белков коннексинов заключается в обеспечении межклеточных взаимодействий путем образованием белковых каналов между близлежащими клетками или с образованием полуканалов, обеспечивающих опосредованное влияние метаболитов, транспортируемых через них в межклеточное пространство [8]. Кроме того, есть данные о том, что коннексин-43 принимает участие в коммуникациях, обеспечиваемых образованием микровезикул [9]. В дополнение к известной канальной роли коннексина-43, у этого белка существует множество функций, независимых от белковых каналов, связанных с изменением цитоскелета. Эти функции обеспечивают изменения в морфологии клеток, регуляцию полярности, влияние на подвижность клеток, благодаря коннексин-опосредованной клеточной адгезии [8, 10, 11]. В исследованиях, посвященных клеткам разного типа опухолей показано, что цитоплазматические коннексины участвуют в активации миграции и пролиферации опухолевых клеток [12, 13]. Особый интерес представляет цитоплазматическое накопление коннексина-43, выявленное в настоящем исследовании. Можно предположить, что коннексин-43, присутствующий в клетках эндоневрия регенерирующего нерва, выполняет не только канальные функции, но также участвует в клеточной адгезии и обеспечивает повышенную подвижность, пластичность, миграцию и пролиферацию клеток, которые способствуют ремоделированию тканей, вызванному повреждением. Также накопление белка в цитоплазме клеток может быть связано с активным направленным транспортом Cx43-содержащих везикул к формирующимся бляшкам щелевых контактов с участием микротрубочек [10].

В настоящей работе установлено, что Сх43 начинает экспрессироваться в клетках дистального сегмента поврежденного нерва крысы через 7 сут после операции. Эти данные согласуются с результатами исследований, выполненных в работах 90-ых годов прошлого века [3]. Данные о том, какие именно клеточные элементы начинают синтезировать Сх43 в нерве после его повреждения, противоречивы.

Известно, что после повреждения дистальный конец нерва подвергается валлеровской дегенерации, в которой активное участие принимают макрофаги, шванновские клетки, фибробласты. Таким образом, выявленные в настоящем исследовании коннексин-43-иммунопозитивные клетки могут относиться к следующим клеточным популяциям: активированным макрофагам или глиальным клеткам-предшественникам и, возможно, фибробластоподобным клеткам. Сх43 может содержаться в клетках макрофагального ряда. В литературе имеются данные о возможности макрофагов различных тканей синтезировать коннексин-43 [9, 14, 15]. Показано, что предшественники шванновских клеток содержат коннексин-43 [16] и ряд исследований, выполненных в 90-х годах с применением вестерн-блоттинга и иммуногистохимии, демонстрирует присутствие белка в шванновских клетках [4, 17, 18]. Однако другими исследователями, в работах с применением двойного маркирования, доказано, что шванновские клетки не экспрессируют Cx43 [3]. По нашему мнению, обнаруженные нами в эндоневрии поврежденного нерва Сх43-иммунопозитивные клетки предположительно относятся к фибробластоподобным клеткам. В пользу этого свидетельствует тот факт, что выявленные коннексин-43-содержащие клетки, обладают морфологическими признаками активированных фибробластов: имеют крупные размеры, овальное ядро и отростки. Для подтверждения этого требуются дальнейшие исследования, выполненные с применением двойного маркирования.

ВЫВОДЫ

Показано, что в седалищном нерве крысы коннексин-43-иммунопозитивные клетки присутствуют в периневральной и эпиневральной оболочках. Установлено, что клетки, содержащие коннексин-43, идентифицируются в эндоневрии седалищного нерва только после повреждения. Для уточнения принадлежности таких коннексин-43-содержащих клеток эндоневрия к определенному клеточному типу необходимо проведение дополнительных исследований.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 23-25-10003, https://rscf.ru/project/23-25-10003/) и Санкт-Петербургского научного фонда в соответствии с соглашением от 05.05.2023 г. № 23-25-10003.

Funding source. The study was supported by the Russian Science Foundation (project no. 23-25-10003, https://rscf.ru/project/23-25-10003) and the St. Petersburg Science Foundation in accordance with agreement no. 23-25-10003 dated May 5, 2023.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Е.А. Колос: разработка плана исследования, постановка иммуногистохимических реакций, проведение анализа материала, написание текста статьи.

Author contribution: E.A. Kolos: developing a research plan, performing immunohistochemical reactions, analyzing the material, writing the text of the article.

Рис.1.Структура интактного седалищного нерва крысы. En – эндоневрий; Ep – эпиневрий; звездочка – субпериневральное пространство; двойные стрелки – клетки периневрия (а); коннексин-43-иммунопозитивные клетки периневрия (b). Окраска гематокмилином и эозином (а); иммуногистохимическая реакция на коннексин-43 (b). Масштабный отрезок: 20 мкм.

Fig. 1. Structure of the intact rat sciatic nerve. En – endoneurium; Ep – epineurium; asterisk – subperineurial space; double arrows – perineurium cells (a); connexin-43-immunopositive perineurial cells (b). Staining with hematoxylin and eosin (a); immunohistochemical reaction for connexin-43 (b). Scale bar: 20 µm.

Рис. 2. Коннексин-43-иммунопозитивные структуры эндоневрия седалищного нерва крысы. а – интактный нерв; b, c, d – поврежденный нерв (7 сут после наложения лигатуры). Иммуногистохимическая реакция на коннексин-43, подкраска астровым синим. Масштабный отрезок: 50 мкм (а, b); 20 мкм (c, d).

Fig. 2. Connexin-43-immunopositive structures of the endoneurium of rat sciatic nerve. a – intact nerve; b, c, d – damaged nerve (7 days after ligation). Immunohistochemical reaction for connexin-43, staining with aster blue. Scale bar: 50 µm (a, b); 20 µm (c, d).

About the authors

Elena A. Kolos

Author for correspondence.
Email: koloselena1984@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9643-6831
SPIN-code: 1479-5992
Scopus Author ID: https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=55354374400
ResearcherId: D-1579-2012

Researcher

References

Supplementary files