Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Одним из фундаментальных свойств живого является ритмичность протекания биологических процессов на разных уровнях организации [1, 2]. Среди множества биоритмов с различным периодом колебания, наиболее важными для млекопитающих являются циркадианные (циркадные) ритмы (ЦР). Эти ритмы связанные с периодической сменой дня и ночи, они сформировались в процессе адаптации к условиям светового цикла на планете [3, 4].

К настоящему времени в организме млекопитающих охарактеризовано более чем 500 различных функций и процессов, протекающих в зависимости от циркадианных ритмов. ЦР функций и процессов в организме, отличающиеся друг от друга амплитудой и фазой, в норме строго согласованы между собой и с факторами внешней среды, что обеспечивает поддержание функционирования органов и систем организма на оптимальном уровне [5-8]. К настоящему времени хорошо известно, что практически всем физиологическим процессам, обладающим циркадианной ритмичностью, свойственны половые различия [9, 10].

ЦР млекопитающих могут проявлять автономность, что обусловлено наличием в клетках «часовых генов», образующих молекулярно-генетическое звено биологических часов. Оно включает в себя ген Bmal, работающий в паре с геном Clock, семейство генов Per (Per1, Per2, Per3) и гены Cry (Cry1, Cry2), кодирующие белки криптохромы, а так же другими генами, обеспечивающими системе дополнительную надежность [11-13].

Однако ЦР чаще всего модулируются влиянием факторов внешней и внутренней среды [14], что обеспечивает адаптацию организма. Чередование периодов света и темноты – наиболее важный регулятор разнообразных физиологических ритмов для млекопитающих, включая человека. Смена света и темноты оказывает влияние на период и амплитуду ЦР, экспрессию генов и согласование всего комплекса суточных ритмов между собой [15, 16].

К настоящему времени бóльшая часть исследователей считает основным водителем ЦР в многоосцилляторной системе млекопитающих парные супрахиазматические ядра гипоталамуса (СХЯ). Ритмоорганизующая функция СХЯ модулируется извне датчиками времени, наиболее важным из которых является свет. Важнейшим участником ансамбля, регулирующего структуру ЦР млекопитающих, является эпифиз. Эта железа связана с СХЯ, от которых она получает информацию об освещенности, от чего и зависит сама выработка эпифизом мелатонина и её ритмичность [17].

К одним из наиболее значимых факторов дезорганизации биоритмов в современном мире относят нарушение режима света-темноты, в частности, световое загрязнение (темновая депривация) – воздействие света в ночное время, нарушающее эндогенный циркадианный ритм, а также подавляющее ночную секрецию мелатонина эпифизом [18]. Последнее имеет следствием ускоренное старение, развитие онкологических и обменных патологий, а также заболеваний органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и сердечно-сосудистой системы [19, 20]. Еще одним хронодеструктором является алкоголь, действие которого которое может проявиться как на уровне часовых генов, так и на иерархически более высоких уровнях системы регуляции циркадианной ритмичности организма млекопитающих [21, 22].

Большая часть исследований, посвященных изучению циркадных ритмов, рассматривает проявления суточной периодичности физиологических, биохимических, молекулярно-генетических процессов, и лишь небольшой ряд работ посвящен ЦР морфологических параметров, и уж совсем небольшая часть посвящена изучению морфологических проявления суточной ритмичности на клеточном и органоидном уровне в норме и при патологии. В частности, для клеточного ядра описаны ЦР полиплоидии, архитектуры хроматина, размеров самого ядра [23-25]. Обнаружены суточные ритмы количества и морфологических параметров митохондрий [26], эндоплазматической сети [27, 28] и лизосом [29].

Одной из традиционных моделей изучения биоритмов на органном и клеточном уровне является печень. Рядом ранее проведенных исследований нами показано, что темновая депривация и хроническая алкогольная интоксикация, действуя как по отдельности, так и совместно, вызывают ряд неблагоприятных структурных изменений в гепатоцитах крыс, а так же вызывают существенные нарушения в циркадном ритмостазе печени [30, 31]. Однако, исследований, посвященных ЦР органоидов гепатоцитов в экспериментальных условиях нами не обнаружено.

В связи с этим, целью исследования явилось изучение суточной динамики площади поперечного сечения митохондрий гепатоцитов у крыс обоего пола в условиях темновой депривации (дефицита эпифизарного мелатонина), хронической алкогольной интоксикации и совместного действия этих факторов. Выбор площади поперечного сечения митохондрий в качестве исследуемого параметра обусловлен тем, что этот показателя является одним из наиболее информативных параметров, отражающих функциональное состояние органоида , а кроме того, описано наличие суточной динамики размеров митохондрий в норме [32].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования.

Работа выполнена на 80 самцах и 80 самках крыс аутбредного стока Вистар в возрасте 6 месяцев, с массой тела 350±15 г. Животные были получены из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА России «Столбовая». Все животные содержались в пластиковых клетках, при температуре 20-22°С и относительной влажности воздуха 60-70%; первоначально животных содержали при естественном освещении. Крысы имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», сертификат соответствия № POCCRU.nO81.B00113, ГОСТ P50258-92). Содержание животных и эксперименты выполнены в соответствии с Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). На проведение исследования получено разрешение биоэтического комитета ФГБНУ НИИМЧ им. А.П. Авцына, протокол №34(10) от 14.03.2021.

Дизайн исследования

Крысы были случайным образом разделены на 8 групп.

1-я группа (контроль, самцы, n=20) содержалась при фиксированном световом режиме (свет:темнота/10:14 ч с включением света в 8:00 и выключением в 18:00 ч).

2-я группа (самцы, n=20) содержалась в условиях темновой депривации 24 ч в сутки.

3-я группа (самцы, n=20) содержалась в тех же условиях, что и животные контрольной группы, но эти крысы получали в качестве питья 15-% раствор этанола ad libitum вместо воды, т.е. подвергались хронической алкогольной интоксикации.

4-я группа (самцы, n=20) также содержалась в условиях темновой депривации, животные получали в качестве питья 15-% раствор этанола ad libitum.

5-я группа (контроль, самки, n=20) содержалась при фиксированном световом режиме (свет:темнота/10:14 ч с включением света в 8:00 и выключением в 18:00 ч).

6-я группа (самки, n=20) содержалась в условиях темновой депривации 24 ч в сутки.

7-я группа (самки, n=20) содержалась в тех же условиях, что и контроль, но животные получали в качестве питья 15-% водный раствор этанола ad libitum вместо воды, т.е. подвергались хронической алкогольной интоксикации.

8-я группа (самки, n=20) также содержалась в условиях темновой депривации, животные получали в качестве питья 15-% раствор этанола ad libitum.

Выбор крыс, являющихся ночными животными, в качестве модельного животного обусловлен тем, что рядом исследований подтверждено наличие общей для млекопитающих регуляторной системы циркадной ритмичности организма, что позволяет экстраполировать полученные на крысах данные на млекопитающих других видов, в том числе и на человека, за исключением исследований, связанных с двигательной активностью и изучения пищевого времязадатчика [33].

Отбор самок крыс в экспериментальные группы осуществлялся после определения фазы эстрального цикла по кольпоцитограмме таким образом, чтобы в эксперимент вошли животные в фазе диэструса.

Критерием отбора крыс в исследование, наряду с отсутствием видимых отклонений поведения и внешнего вида животного (состояние шерстного покрова, глаз, конечностей), было исходное предпочтение алкоголя (15-% раствор этилового спирта) водопроводной воде. Для этого был проведен предварительный эксперимент: в течение 3 суток крыс содержали в индивидуальных клетках со свободным доступом к обеим жидкостям.

В течение эксперимента ежедневно определяли объем выпитого раствора этанола, затем вычисляли массу спирта на 1 кг массы тела. В среднем животные обоего пола выпивали 15,48±1,28 мл/сут, что в пересчете на абсолютный этанол составляет 7 г/кг массы тела.

Длительность эксперимента составляла 3 недели.

Выведение крыс из эксперимента осуществляли в углекислотной камере, оборудованной устройством для верхней подачи газа (100% СО₂) в 9:00, 15:00, 21:00 и 3:00. Предварительно у животных осуществляли измерение ректальной температуры. Заполнение объема камеры газом производили со скоростью 20% в минуту во избежание возникновения у животных диспноэ и боли. Под действием газа животные засыпали, после чего проводился забор крови для гематологических и биохимических исследований, также осуществлялась эвисцерация печени.

Электронномикроскопические методы

Образцы печени размером 2 мм³ фиксировали 2,5-% раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), затем дофиксировали в 1-% растворе оксида осмия (OsO₄), обезвоживали в этаноле, в процессе обезвоживания контрастировали 1-% уранилацетатом на 70-% этаноле и проводили заливку в смесь эпон–аралдит по стандартной методике [34].

Ультратонкие срезы, полученные на ультратоме LKB-III (LKB Produkter, Швеция), дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония). Фотофиксация препаратов осуществлялась с помощью камеры Gatan ES500W Erlangshen (Model 782) (Gatan Inc., США).

Для микроморфометрической оценки митохондриального аппарата гепатоцитов в каждом препарате анализировали 20 непересекающихся полей зрения при увеличении 20 тыс. Для стандартизации результатов исследования на полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, для анализа выбирали однотипные участки - промежуточную зону печеночных долек [35]. При помощи программы «ImageJ» определяли площадь сечения одной митохондрии.

Методы статистической обработки.

Построение графиков, иллюстрирующих суточную динамику исследуемого параметра и статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism v8.41 (США)..

Для статистического расчета амплитуды и акрофазы ЦР осуществляли косинор-анализ – международный, общепризнанный метод унифицированного исследования биологических ритмов, с использованием программы CosinorEllipse2006-1.1.

Косинор-анализ предназначен для анализа волновых процессов и обработки хронобиологических данных. При проведении анализа экспериментальные данные аппроксимируются методом наименьших квадратов синусоидой. Определялось наличие достоверного циркадианного ритма, а также его акрофаза и амплитуда. Выходной информацией косинор-анализа являются основные параметры ритмов: мезор, т.е. величина среднего уровня синусоиды (h), амплитуда синусоиды (А) и акрофаза (Phi), то есть время наступления максимума функции. Мезор совпадает по величине со среднесуточным значением исследуемой функции. Акрофаза — это мера пикового времени общей ритмической изменчивости за 24-часовой период, т.е. время наступления максимума функции. Амплитуда соответствует половине общей ритмической изменчивости в цикле. Акрофазу выражают в часах; значения амплитуды выражаются в тех же единицах, что и исследуемые переменные.

Затем осуществляется построение эллипса ошибок, необходимого для определения достоверности существования ритмов на принятом доверительном уровне (в данном исследовании, на уровне 0,95). Синусоида изображается на плоскости точкой, полярные координаты которой — амплитуда и акрофаза. Все полученные таким образом точки в декартовых координатах рассматриваются как реализации двумерной случайной величины с гипотетически нормальным законом распределения, и строится эллипс рассеивания ошибок генерального среднего. Циркадианный ритм считается достоверным при выполнении двух условий: усреднённая аппроксимирующая хронограммы синусоида (изображенная крестиком) должна входить в эллипс, а сам эллипс не должен проходить через центр координат (т.к. в данном случае акрофаза будет приходиться на весь 24 ч период) [36, 37].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенное исследование показало, что площадь поперечного сечения митохондрий гепатоцитов как самцов, так и самок контрольной группы в норме характеризуются суточной динамикой с максимумом в 15 часов и снижением до минимума к 3 часам (рис. 1). По результатам косинор-анализа фазово-амплитудные характеристики обнаруженного ЦР так же характеризуются сходными параметрами- в гепатоцитах самцов акрофаза ритма поперечного сечения отмечается в 14²⁷, амплитуда его составляет 0,083 мкм², у самок акрофаза ритма отмечена в 14¹⁹при амплитуде 0,057 мкм² (рис. 2).

Под влиянием темновой депривации суточная динамика площади поперечного сечения митохондрий гепатоцитов самцов практически не изменяется, ЦР присутствует, и характеризуется акрофазой, сместившейся на 13¹⁶ и значительным уменьшением амплитуды ритма, составившей 0,048 мкм². В тех же условиях в гепатоцитах самок максимальных размеров митохондрии достигают в утренние часы при сохранившемся минимуме в 3 часа. По данным косино-анализа акрофаза ритма смещается на 12⁰⁷ при амплитуде 0,063 мкм².

Рис.1. Суточная динамика площади поперечного сечения митохондрий гепатоцитов. А – самцы, B - самки. ТД – темновая депривация, ХАИ – хроническая алкогольная интоксикация.

Fig.1. Daily dynamics of the cross-sectional area of hepatocyte mitochondria. A – males, B – females. TD – dark deprivation, CAI – chronic alcohol intoxication.

Хроническая алкогольная интоксикация вызывает значительные изменения суточной динамики размеров митохондрий в гепатоцитах самцов. Максимум ритма смещается на вечерние часы при сохраняющемся минимуме в 21 час. При этом, акрофаза ЦР мигрирует на 13²¹, амплитуда его составляет 0,075 мкм². В гепатоцитах самок параметры суточной динамики ритма характеризуются максимумом в 9 часов при сохраняющемся минимуме в 3 часа, а косинор-анализ показал акрофазу в 11⁵⁸ при амплитуде 0,084 мкм².

Совместное действие этанола и темновой депривации так же вызывает изменение суточной динамики исследуемого параметра у самцов. В этом случае  при максимуме площади поперечного сечения митохондрий в 9 часов минимальные значения отмечаются в 21 час, а акрофаза ритма смещается на 8¹⁹ с амплитудой 0,076 мкм². У самок в тех же условиях форма хронограммы практически совпадает с таковой у животных 2 группы, акрофаза ритма, приходящаяся на 11⁴¹ так же практически совпадает с показателями самок 2 группы, но амплитуда ритма увеличивается до 0,106 мкм^2..

Рис. 2. Результаты косинор-анализа суточного ритма площади поперечного сечения митохондрий гепатоцитов. А –самцы, B- самки. ТД – темновая депривация, ХАИ – хроническая алкогольная интоксикация.

Fig. 2. Results of cosinor analysis of the daily rhythm of the cross-sectional area of hepatocyte mitochondria. A – males, B – females. TD – dark deprivation, CAI – chronic alcohol intoxication.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование позволило установить наличие четкого и достоверного циркадного ритма размеров митохондрий в гепатоцитах крыс контрольных групп обоего пола. Примечательно, что в условиях фиксированного светового режима как форма хронограммы, так и характеристики самого ЦР не продемонстрировали значимых межполовых различий. Согласно литературным данным, предполагается, что в поддержании циркадной ритмичности размеров митохондрий в норме ведущая роль принадлежит гену bmal1, а так же сопряженными с ним генами [38, 39].

Однако, не менее важными факторам, определяющими циркадную ритмичность морфологических и функциональных характеристик митохондрий являются и, как  тканеспецифичность ритма, а так же влияние факторов внешней и внутренней среды (двигательная активность, режим питания, митотическая активность клеток, их дифференцировка) [40-42].

Темновая депривация и хроническая алкогольная интоксикация, действуя и как монофактор, и совместно, вызывают перестройку циркадной ритмичности размеров митохондрий гепатоцитов.

Примечательно, что у животных всех групп ЦР перестраиваются, ни в одной группе не наблюдается разрушений ритма. Ранее проведенные нами исследования [16, 30, 31] свидетельствуют о том, что совместное влияние постоянного освещения приводит к разрушению в гепатоцитах ЦР экспрессии основных генов, регулирующих циркадные ритмы на клеточном уровне (per2, clock, bmal1), а у самцов аналогичноый эффект оказывает и темновая депривация как монофактор. Таким образом, а данном случае можно предположить, что в поддержании исследованного циркадного ритма площади поперечного сечения митохондрии регуляторные часовые гены принимают как минимум не основное участие.

В то же время в тех же исследованиях нами показано, что ЦР всего спектра исследованных параметров наименее лабильным оказывается ЦР содержания глюкозы в крови. При сопоставлении параметров этого ритма с ритмом площади митохондрий обнаруживается, что у животных контрольных групп совпадают по времени акрофазы ритмов глюкозы и площади митохондрий, при этом акрофаза глюкозы отмечается на 1 час раньше.

В дальнейшем, под влиянием ХАИ и темновой депривации, ритм глюкозы у самцов характеризовался акрофазой, «мигрирующей» в диапазоне от 11³⁶ до 15⁰⁵ часов, но синхронизации его с ЦР площади митохондрий не отмечается. У самок в тех же условиях акрофаза ритма располагается в диапазоне от 12⁴⁰ до 13¹¹, всегда опережая акрофазу ЦР площади митохондрий не более чем на 90 минут. С учетом данных о том, что увеличение размеров митохондрий отражает усиление продукции в них АТФ [43, 44], можно предположить, что в печени ведущим времязадатчиком в отношении митохондрий оказывается режим питания.

Кроме того, проведенное исследование показывает, что ЦР размеров митохондрий гепатоцитов самок по сравнению с самцами оказываются более устойчивыми к действию темновой депривации и алкогольной интоксикации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования впервые установлено, что размеры митохондрий гепатоцитов самцов и самок крыс в норме характеризуются сходными характеристиками циркадного ритма. Показано, что как отдельно-, так и совместнодействующие факторы - темновая депривация и хроническая алкогольная интоксикация вызывают перестройку исследованных ЦР, при этом ритм размеров митохондрий самок оказывается менее пластичным, чем у самцов. Вопрос существования этого различия, а так же механизмы перестройки ритмов и роль в этом процессе внешних и внутренних времязадатчиков остается открытым и требует дальнейшего изучения.

About the authors

David A

Author for correspondence.
Email: labcelpat@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3006-6281

David A. Areshidze – Cand. Sci. (Biol.), Leading Research Associate, Head of Laboratory of Pathology of Cell of the Federal State Budgetary Institution «A.P. Avtsyn Research Institute of Human Morphology»,

References

Supplementary files