The ratio of proliferation and apoptosis in connective tissue cells of the skin during the healing of mechanical injury in an experiment

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Несмотря на внимание ученых к оценке жизнеспособности тканевых клеток, этот вопрос нельзя считать окончательно изученным. В настоящее время значительный интерес вызывает изучение молекулярных факторов, контролирующих пролиферацию и апоптоз. Одним из информативных методов изучения внутриклеточных механизмов является иммуногистохимия [1, 2].  Анализ публикаций свидетельствует о том, что некоторые из иммуногистохимических маркеров, выявляющих пролиферацию и гибель клетки, уже нашли свое место в научно-исследовательском и диагностическом процессах, в то время как значимость и область применения других продолжает изучаться [3, 4, 5]. В качестве маркеров пролиферации используется ряд белков, участвующих в регуляции клеточного цикла. Одним из недавно введенных в практику, но еще не получивших широкого распространения высокоспецифичных маркеров митотически делящихся клеток, является фосфорилированный гистон Н3. Гистоны представляют собой небольшие основные белки, консервативные у всех эукариот. Молекула гистона содержит глобулярную С-концевую часть и аморфный N-конец. Фосфорилирование молекулы гистона Н3 по серину в N-конце происходит при делении клетки в начале митоза, при выходе клетки из митоза происходит дефосфорилирование гистона Н3 [5]. Распространенным маркером, отражающим проапоптотическую активность и определяемым в клинике, является р53 [6]. Однако, повышенная экспрессия белка р53 отражает митохондриальный путь апоптоза, тогда как существует каспаза-зависимый путь, запуск которого в клетке невозможно определить маркированием антителами к р53. Поэтому для достоверного определения количества апоптотических клеток нами был использован комплекс маркеров, включающий также антитела к каспазе 3, маркирующие клетки, в которых запущен процесс апоптоза по каспаза-зависимому пути.

Процессы пролиферации и клеточной гибели являются неотъемлемой частью физиологического и регенерационного гистогенеза [7]. Однако отсутствуют публикации, в которых бы производилась попытка оценить сдвиг пролиферативно-апоптотического баланса при заживлении ран после механической травмы кожи. Существует необходимость разработки унифицированных иммуногистохимических методов, позволяющих сравнить соотношение указанных закономерных гистогенетических процессов в поврежденных тканях.

ЦЕЛЬ

Количественно охарактеризовать соотношение пролиферации и апоптотической гибели клеток дермы на этапах заживления механической кожной раны.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое сплошное контролируемое рандомизированное неослепленное исследование. Объекты исследования – фрагменты кожи крыс линии Wistar, взятые в области средней трети бедра на разных сроках заживления после нанесения глубокой резаной раны. Биоптаты использовались для приготовления парафиновых срезов и постановки иммуногистохимической реакции антителами к к фосфорилированному гистону Н3, каспазе 3 и р53. Получившиеся препараты были оцифрованы для дальнейшего анализа динамики количественных параметров (рассчитано общее число иммунопозитивных к каждому маркеру клеток на разных сроках эксперимента) и их статистической обработки.

Критерии соответствия

          В исследование были включены 27 животных исходной массой 180 – 200 г, в возрасте 30-45 суток.

Условия проведения

Экспериментальная часть работы выполнена в условиях сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны РФ (Соглашение о научном сотрудничестве № 15 между Военно-медицинской академией имени С.М. Кирова и ГНИИИ ВМ МО РФ от 13.09.2023 г.). Морфометрическая и статистическая обработка выполнена на кафедре гистологии с курсом эмбриологии ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Продолжительность исследования

Взятие экспериментального материала (лоскуты кожи в месте ранения с прилежащими не поврежденными тканями) проводили через 12 ч, 24 ч, 2-е, 3-е, 6, 10, 15, 25 суток после повреждения. Выведение животных из опыта проводилось путем передозировки комбинации анестетиков (золетил-ксилазин, внутримышечное введение смеси).

Описание медицинского вмешательства

Животные разделены на группы, которые помещались в одну промаркированную клетку (одна клетка на каждый срок взятия экспериментального материала). Эксперимент проводился в утренние часы, в день эксперимента каждая особь подвергалась золетил-ксилазиновому наркозу (внутримышечное введение смеси, каждого вещества по 10 мг/кг массы крысы). Животным наносили повреждение в виде глубокого поперечного разреза кожи средней части бедра с помощью острого скальпеля. Протяженность разреза в длину варьировала от 1,5 до 2 см. Первичная хирургическая обработка раны не проводилась, повязки не накладывались. После нанесения повреждения животные помещались в соответствующую клетку до достижения определенного срока регенерации.  Взятие экспериментального материала (лоскуты кожи в месте ранения с прилежащими не поврежденными тканями) проводили через 12 ч, 24 ч, 2-е, 3-е, 6, 10, 15, 25 суток после повреждения. Для интактного контроля использовали кожу конечности крыс без механических повреждений.

Основной исход исследования

          С помощью метода иммуногистохимических реакций с антителами к каспазе 3 и р53 удалось проследить динамику количества гибнущих клеток в перинекротической области раны на этапах раневого процесса, а также подтвердить достоверность данного метода исследования механической травмы кожи. Также выяснено, что иммуногистохимическая реакция с антителами к фосфорилированному гистону Н3 дает адекватный результат при маркировании делящихся клеток в соединительных тканях дермы, но имеет функциональные ограничения. Статистическая обработка полученных в ходе иммуногистохимических исследований количественных данных позволила вывести пролиферативно-апоптотический индекс, который может быть использован как критерий определения фаз раневого процесса.

Анализ в группах

          Особи были разделены на группы: 1-я – интактные особи (контрольная группа, n=3), остальные группы соответствуют срокам выведения из эксперимента соответственно на 12ч, 24 ч, 2-е, 3-е, 6, 10, 15 и 25 суток после нанесения механической травмы (n = 3 для каждой группы).

Методы регистрации исходов

Иммуногистохимическое исследование.

Иммуногистохимические реакции проводили с применением кроличьих поликлональных антител фирмы Abcam (Великобритания), в разведении 1:1200 с целью выявления маркера, соответствующего экспрессии фосфорилированного гистона Н3, мышиных моноклональных антител (клон DO-7) фирмы Dako (Дания) в разведении 1:200 с целью выявления маркера, соответствующего экспрессии белка р53, а также кроличьих поликлональных антител фирмы ABclonal Biotechnology  Co (Китай), в разведении 1:700 с целью выявления маркера, соответствующего экспрессии каспазы 3. Образцы кожи  фиксировали в забуференном 10%-ном растворе формалина. Через 24 часа перекладывали в 96% этиловый спирт. Далее после прохождения всех этапов проводки материал был залит в парафиновые блоки, размещенные на специальных пластиковых кассетах. Парафиновые срезы были изготовлены с использованием ручного санного микротома Sakura (Япония). Срезы толщиной 5 мкм были помещены на предметные стекла с полилизиновым покрытием. Для просушивания стекла со срезами были помещены в термостат на 12 часов при t = 37^o C. Далее препараты депарафинировали и регидратировали в двух сменах ксилола (по 10 мин каждая), регидратировали срезы в спиртах нисходящей концентрации (две смены 96% этанола по 5 мин, одна смена 80% этанола – 5 мин) и промывали в дистиллированной воде (5 мин). Помещали препараты в цитратный буфер S-1700 (Dako, Дания), предварительно нагретый в термостате до 60^о. Тепловое демаскирование антигена проводили в пароварке в течение 20-25 минут. Промывали срезы в дистиллированной воде в течение 5 минут и помещали их в 3% раствор пероксида водорода (Н2О2) на 10 минут, далее, после промывки помещали в раствор 0,01М фосфатно-солевого буфера (PBS, Биолот, Россия) (pH 7,4) на 5 минут. Для блокировки вторичных антител использовали блокировочный раствор (Protein Block DP-125, Spring Bioscience, США) и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. После удаления блокировочного раствора наносили раствор первичных антител. Препараты помещали во влажные камеры и инкубировали при температуре 27^о. После инкубации в первичных антителах, препараты промывали в двух сменах PBS и наносили анти-кроличьи вторичные реагенты, коньюгированные с полимером и пероксидазой хрена для связывания соответствующих первичных антител. Инкубацию проводили во влажных камерах в термостате при 27^о в течение 30-40 мин. После промывки в PBS на срезы наносили необходимое количество рабочего раствора 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида (Dako, Дания) для выявления продукта иммуногистохимической реакции. Образование окрашенного продукта реакции происходило в течение 1-3 мин. После достижения оптимальной окраски срезов, контроль которой осуществляли под микроскопом, препараты промывали в 3-% растворе пероксида водорода и дистиллированной воде (3 смены по 5 мин). Препараты промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в изопропиловом спирте и смеси изопропилового спирта и ксилола (1:1), просветляли в ксилоле  и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Thermo Scientific, США). Для визуализации иммуногистохимической реакции применяли световой микроскоп Zeiss Axio Scope.A1 со встроенной фотокамерой Zeiss Axiocam ERc 5s  (Zeiss, Германия).

Морфометрическое исследование

Для морфометрического анализа оцифрованных изображений со светового микроскопа Zeiss Axio Scope.A1 со встроенной фотокамерой Zeiss Axiocam ERc 5s использовали лицензированное программное обеспечение Zen 2.3. Меченые антителами клетки визуализировали на 10 полях зрения в перинекротической области и в автоматическом режиме при помощи опции «точки» подсчитывали их количество. Числовые данные заносились в таблицы Excel для формирования графиков и дальнейшей статистической обработки.

Этическая экспертиза

Условия содержания и кормления экспериментальных животных соответствовали принципам биоэтики и «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Хельсинкская декларация, 2000 г.), а также в соответствии с законом «О защите животных от жестокого обращения» (глава V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.); приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г., приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Протокол проведения исследований был одобрен комиссией независимого локального этического комитета ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Выписка из протокола заседания Локального этического комитета от 17.10.2023 г (протокол №283).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных.

Полученные в результате подсчета числовые данные обрабатывали с использованием компьютерной программы Excel и программного пакета Statistica 10.0 (StatSoft, США). Тип распределения устанавливали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса. При нормальном распределении данных применяли t-тест Стьюдента и представляли значения в виде средней величины и стандартного отклонения. При распределении, отличающемся от нормального, использовали U-критерий Манна-Уитни для двух групп (попарный анализ). Различия считались статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты

Объекты исследования

Фрагменты кожи средней трети поверхности бедра крыс породы Wistar после нанесения глубокой резаной раны. Биоптаты размером 1,5 – 2 см включали раневой канал и окружающие его визуально не поврежденные ткани кожи.

Основные результаты исследования.

В дерме экспериментальных животных всех групп обнаруживаются иммунопозитивные к фосфогистону Н3, каспазе 3 и р53 клетки (рис.1).
Рис.1. Кожа бедра крысы. 6-е сутки эксперимента. Перинекротическая зона:
а - иммуногистохимическая реакция с антителами к фосфогистону Н3 (увеличение ×400);
b -  иммуногистохимическая реакция с антителами к каспазе 3 (увеличение ×400);
с - иммуногистохимическая реакция с антителами к р53 (увеличение ×400). Стрелками указаны иммуноположительные клетки.

В контрольной группе индекс пролиферации (процентное отношение клеток с иммунореактивными ядрами на 10 полях зрения к общему числу клеток) в соединительных тканях дермы составил 2,6%. Через 12 ч после травмы этот показатель составил 0,14% (снижение на 94,6%). В ходе раневого процесса количество делящихся клеток закономерно увеличивается и достигает максимальных значений через 24 часа и через 6 суток с начала эксперимента (индекс пролиферации - 8,3% и 8,9% соответственно). На заключительном этапе эксперимента, через 25 суток, индекс пролиферации составил 1,75%, что меньше, чем в интактной коже на 32,7% (рис.2).

Рис.2. Динамика индекса пролиферации соединительнотканных клеток кожи в перинекротической области раны в зависимости от фазы раневого процесса

Иммунопозитивные к маркерам апоптоза клетки в интактной коже единичны (каспаза 3 – иммуноположительных клеток - 2,8±2,9; р53-иммуноположительных клеток - 3,4±2,5). Через 12 часов после механической травмы наблюдается значительное повышение их количества. Первым «пиковые» значения демонстрирует маркер экспрессии белка р53 (через 24 часа после травмы количество иммунопозитивных клеток составляет 48,3±4,6). Последующие «пики» экспрессии р53 приходятся на 3-и и 15-е сутки эксперимента (36,1±0,4 и 35,6±0,1 иммунопозитивных клеток соответственно). Наименьшее количество р53-иммуноположительных клеток выявлено на 2-е и 6-е сутки эксперимента (14,4±0,2 и 14,6±0,2). Через 25 суток после травмы мы обнаружили эти клетки в единичном количестве, аналогично показателям интактной кожи.

Повышенная экспрессия каспазы 3, относительно показателей интактной кожи, наблюдается через 12-24 ч после травмы (23,3±1,1 клетки через 12ч и 26,8±0,13 через 24 ч). Однако, максимальное количество каспаза 3-иммуноположительных клеток установлено только через 2-е суток после травмы (81,1± 0,32), а абсолютный максимум значений пришелся на 10-е сутки с начала эксперимента (90,3±1,2). Необходимо отметить, что общее количество таких клеток превышает количество р53-иммуноположительных клеток на протяжении всего эксперимента (рис.3).

Рис.3. Динамика количества р53- и каспаза 3 – иммуноположительных клеток зависимости от фазы раневого процесса

Исследование перинекротической области кожной раны показало, что процессы клеточной гибели на начальных этапах посттравматического гистогенеза преобладают над пролиферативными и достоверно отличаются от контроля (рис. 3). В то же время, оценка интенсивности пролиферации по количеству клеток в начальной фазе митоза показывает резкое снижение в первые часы после ранения, но достоверно повышается уже к концу первых суток эксперимента (рис. 2).

Поскольку гомеостаз в ткани регулируется соотношением пролиферации и гибели клеток, сравнительный анализ показателей, отражающих данные процессы, может являться значимым диагностическим критерием. Для оценки соотношения пролиферации и апоптоза, используя данные о количестве клеток в начальной фазе митоза и общем количестве апоптотических клеток, были произведены вычисления по формуле М/(aр+ас), где М – количество пролиферирующих клеток, ар – «митохондриальный» апоптоз, т.е. количество клеток с апоптозными частицами, связывающимися с антителами, специфичными к р53 – маркеру, а ас – количество клеток в процессе каспаза-зависимого апоптоза (рис.4). Полученный таким образом индекс (ПАИ) комплексно отражает соотношение делящихся и гибнущих клеток в исследуемой ткани. Полученные наименьшие значения пролиферативно-апоптотического индекса (М/(aр+ас)) являются следствием более высокого уровня апоптоза и вероятной меньшей скорости образования новых клеток (пролиферации).

Рис.4. Динамика количества пролиферирующих и гибнущих клеток на этапах эксперимента

В результате расчетов выяснилось, что наибольшая величина пролиферативно-апоптотического индекса получена для интактной кожи (ПАИ = 2,25). В первые часы после травмы показатель резко падает (ПАИ = 0,02 через 12 ч и 0,05 через 24 часа с начала эксперимента). По мере развития процессов регенерации индекс, отражающий баланс между пролиферацией и апоптозом, оказался наиболее высоким через 6 суток после травмы, тогда как на 10-15 сутки снова снизился до 0,2. Это связано, вероятно, с отсроченной гибелью клеток в перинекротической области раны. К 25-м суткам регенерационного гистогенеза значение индекса стремится к условно нормальному показателю и составляет 1,45 (рис.5).

Рис.5. Динамика пролиферативно-апоптотического индекса в зависимости от фаз раневого процесса

ОБСУЖДЕНИЕ

          Резюме основного результата исследования

Для оценки течения раневого процесса была реализована экспериментальная модель, с помощью которой мы предприняли попытку оценить соотношение закономерных процессов пролиферации и апоптоза при заживлении кожи с помощью комплекса иммуногистохимических реакций с последующей статистической обработкой данных и математических вычислений. Анализируя отдельно индекс пролиферации на этапах регенерации и показатели апоптотической гибели клеток мы проследили закономерную динамику этих процессов и вывели индекс пролиферативно-апоптотического соотношения. Значения индекса в интактной коже приняли за «условно нормальный». Сравнение индексов на этапах регенерации подтверждает, что данный метод отражает характерные для фаз раневого процесса изменения гомеостаза и может являться диагностическим критерием. Однако, специфика примененного для выявления пролиферации иммуногистохимического маркера (фосфогистон Н3) не позволяет в полной мере оценить количество делящихся клеток в ткани, т.к. является специфичным только для клеток, находящихся в поздней G2 – начальной М фазе жизненного цикла клетки и, вероятно, требует применения дополнительного маркера для объективной оценки количества пролиферирующих тканевых клеток.

 

Обсуждение основных результатов.

Для механических ран кожи выделяют три зоны: раневой канал, зона прямого травматического некроза и перинекротическая область, которая начинается с первого сохранившего жизнеспособность корня волоса. Здесь разворачиваются ключевые гистологические проявления регенерации, а для их правильного развития критически важен клеточный баланс, который является результатом одновременной реализации механизмов пролиферации и клеточной гибели [8, 9, 10]. Важность взаиморегуляции этих механизмов на молекулярном уровне подчеркивается в работах многих авторов [11, 12]. В морфологических исследованиях последних лет для определения пролиферативной активности в основном применялся маркер Ki67 [13, 14, 15], а в качестве маркера апоптоза чаще всего используется р53 и некоторые другие проапоптотические белки [16, 17]. Однако работ, учитывающих одновременно оба эти процесса при регенерации тканей, практически нет, поэтому считаем перспективным поиск универсального индекса, отражающего их динамическое соотношение в тканях [18]. Кроме того, целесообразным является поиск новых достоверных маркеров этих внутриклеточных механизмов, поэтому мы впервые использовали для выявления пролиферативных процессов фосфогистон Н3 и комбинацию маркеров клеточной гибели для определения значения уровня общего апоптоза (митохондриального и каспаза-зависимого) на последовательных стадиях раневого процесса. Данный подход является принципиально новым фактором при определении индекса, отражающего гомеостаз соединительных тканей кожи в постраневом гистогенезе. В работах некоторых авторов использованы математические методы определения пролиферативно-апоптотического соотношения в тканях со злокачественными изменениями [19]. Взяв эти методы за основу, нами была выведена простая формула для определения пролиферативно-апоптотического соотношения в соединительных тканях дермы на этапах регенерации, в результате была выявлена закономерная динамика этого показателя.

Для физиологической регенерации кожи характерно преобладание процессов пролиферации над процессами клеточной гибели, что в эксперименте подтвердилось высоким значением пролиферативно-апоптотического индекса для кожи контрольной группы животных. Первые часы после механической травмы характеризуются системной воспалительной реакцией, которая проявляется увеличением показателей клеточной гибели и угнетением пролиферативных процессов. Эта реакция нашла отражение в величине пролиферативно-апоптотического индекса, который значимо снизился по отношению к значению контрольных показателей. Известно, что регенерационный гистогенез, следующий за воспалительной реакцией после травмы, характеризуется активной пролиферацией тканевых клеток и наблюдая динамику ПАИ видим, что до 6 суток индекс повышается. Дальнейшее заживление раны характеризуется постепенным увеличением количества клеток (как за счет миграции из прилежащих тканей, так и за счет продолжающейся пролиферации резидентных клеток), но маркеры клеточной гибели также показывают временное увеличение значений. Это объясняется отсроченной гибелью тканевых структур, поэтому в период 10-15 суток эксперимента пролиферативно –апоптотический индекс вновь падает, но при этом в 10 раз превышает значение первых суток после травмы.

Несмотря на то, что у части особей регенерация тканей к 25-м суткам эксперимента визуально полностью завершена, необходимо учитывать индивидуальные особенности течения регенерации у каждой особи. Ввиду этого фактора, к концу эксперимента мы видим, что показатель индекса пролиферации ниже, чем в нулевую фазу регенерации (в интактной коже), однако показатели апоптоза сопоставимы с таковыми в контрольной группе. Выведенный нами индекс отражает это соотношение и на 25-е сутки эксперимента значительно превышает значения предыдущих сроков, однако остается на 35,6% ниже, чем соответствующее значение интактной кожи.

 

Заключение

Предложенный нами одновременный анализ процессов пролиферации и апоптоза в соединительных тканях кожи в постраневом периоде является информативным методом, позволяющим проводить комплексную оценку этих процессов и, вероятно, может служить критерием определения фазы раневого процесса. Результаты исследования показали, что общие значения апоптоза, реализующегося по митохондриальному и каспаза-зависимому механизмам достоверно определяется с помощью комбинации проапоптотических маркеров р53 и каспазы 3. При этом, не смотря на достоверные показатели маркера фосфогистон Н3, для более объективной оценки пролиферативной активности необходимо продолжить исследования. Перспективной областью для применения предложенного нами индекса или аналогичных показателей для оценки клеточного баланса ткани является оценка раны для ее верной и своевременной классификации. Возможно, именно такие показатели позволят объективно определять развитие раневого процесса с плохим прогнозом и предотвращать преобразование острых ран в хронические.

 

 

About the authors

Tatiana Berezovskaia

S.M.Kirov Military Medical Academy of the Ministry of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: lapi2@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-1591-9152
SPIN-code: 2508-7042

Преподаватель кафедры гистологии с курсом эмбриологии

Russian Federation

Irina A. Odintsova

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: odintsova-irina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0143-7402
SPIN-code: 1523-8394

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files