Proliferation to apoptosis ratio in cutaneous connective tissue cells during mechanical injury healing in an experiment

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

При механических ранениях кожи выделяют три зоны: раневой канал, зону прямого травматического некроза и перинекротическую область, границу которой определяют по первому жизнеспособному волосяному фолликулу (рис. 1–4). В процессе репарации именно в перинекротической области происходят ключевые гистологические процессы, для правильного развития которых критически важен баланс между пролиферацией и клеточной гибелью [1–3]. С позиций изучения посттравматической регенерации кожи наименее исследованной областью остаётся дерма как источник основных клеточных компонентов, обеспечивающих гомеостаз и восстановление морфофункциональной организации в постраневом периоде. В работах многих авторов подчёркивается важность взаимной регуляции механизмов пролиферации и программированной клеточной гибели в процессе заживления ран [4, 5]. Значительный интерес представляет изучение молекулярных факторов, контролирующих эти процессы, а одним из наиболее информативных методов в подобных исследованиях является иммуногистохимический анализ [6, 7]. Согласно данным литературы, некоторые из иммуногистохимических маркеров пролиферации и гибели клеток уже нашли своё место в диагностике, тогда как значимость и потенциальная область применения других продолжает изучаться [8–10]. В морфологических исследованиях последних лет для определения пролиферативной активности в основном применяют маркеры Ki-67, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) и другие [11–13]. Относительно недавно в подобных работах для определения пролиферативной активности клеток начали применять маркер Н3S10ph — гистон Н3, фосфорилированный по серину 10 [10]. Распространённым маркером проапоптотической активности является транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл — белок р53 [14]. Он выполняет роль супрессора роста злокачественных опухолей, а соответствующий ген ТР53 относится к антионкогенам [15]. Повышенная экспрессия белка р53 отражает активацию митохондриального пути апоптоза, однако этот маркер не позволяет детектировать каспаза-зависимый путь клеточной гибели. В этой связи, для определения количества всех апоптотических клеток, независимо от пути активации, в качестве маркера мы дополнительно использовали каспазу 3. Несмотря на то, что процессы пролиферации и клеточной гибели являются неотъемлемой частью физиологического и регенерационного гистогенеза, в литературе встречается крайне мало публикаций, в которых авторы характеризуют динамику обоих процессов при заживлении ран после механической травмы кожи с использованием иммуногистохимических реакций, а также проводят оценку сдвига пролиферативно-апоптотического баланса. Существует практическая необходимость в разработке унифицированных иммуногистохимических методов, позволяющих сравнивать соотношение этих закономерных гистогенетических процессов в повреждённых тканях. Кроме того, перспективным направлением видится создание универсального индекса, отражающего процессы пролиферации и апоптоза.

Рис. 1. Интактная кожа бедра крысы: окраска гематоксилином и эозином; объектив ×4, окуляр ×10.

Fig. 1. Intact rat thigh skin: hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Рис. 2. Кожа бедра крысы спустя 2-е суток после нанесения травмы: чёрная стрелка — раневой канал; пунктирная стрелка — зона первичного некроза; окраска гематоксилином и эозином; объектив ×4, окуляр ×10.

Fig. 2. Rat thigh skin 2 days after injury: black arrow, wound channel; dashed arrow, zone of primary necrosis; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Рис. 3. Кожа бедра крысы спустя 6 суток после нанесения травмы: чёрные стрелки — зона первичного некроза; пунктирные стрелки — перинекротическая область; окраска гематоксилином и эозином; объектив ×4, окуляр ×10.

Fig. 3. Rat thigh skin 6 days after injury: black arrows, zone of primary necrosis; dashed arrows, perinecrotic zone; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Рис. 4. Кожа бедра крысы спустя 10 суток после нанесения травмы — перинекротическая область: окраска гематоксилином и эозином; объектив ×4, окуляр ×10.

Fig. 4. Rat thigh skin 10 days after injury: perinecrotic zone; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Цель — количественно охарактеризовать соотношение процессов пролиферации и апоптотической гибели клеток в соединительной ткани кожи на разных этапах заживления механической раны.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое сплошное контролируемое рандомизированное неослеплённое исследование. Объект исследования — фрагменты кожи бедра самцов крыс линии Wistar на разных этапах заживления после нанесения механического повреждения — глубокой резаной раны. Полученные после стандартной гистологической проводки парафиновые срезы окрашивали иммуногистохимическим методом с использованием антител к фосфорилированному гистону Н3, каспазе 3 и белку р53. Препараты оцифровывали для дальнейшего анализа динамики количественных параметров — подсчёта общего числа иммунопозитивных клеток к каждому из маркеров на разных сроках после травмы. Проводили статистическую обработку полученных данных.

Критерии соответствия

В исследование включены 27 самцов крыс с исходной массой тела 180–200 г, в возрасте 30–45 суток.

Условия проведения

Экспериментальная часть работы выполнена в условиях сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны РФ (Соглашение о научном сотрудничестве № 15 между Военно-медицинской академией имени С.М. Кирова и ГНИИИ ВМ МО РФ от 13.09.2023 г.). Морфометрическая и статистическая обработка выполнены на кафедре гистологии с курсом эмбриологии ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Материал для исследования (фрагменты кожи) получали в следующих временных точках: спустя 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток после нанесения механической травмы кожи.

Описание вмешательства

Крыс содержали по группам, соответствующим срокам выведения из эксперимента, в отдельных промаркированных клетках при комбинированном освещении без применения систем автоматизации. Манипуляции проводили в утренние часы. В качестве наркоза использовали смесь тилетамина и золазепама (препарат Золетил®; Vibrac, Франция; доза 10 мг/кг) в сочетании с ксилазином (10 мг/ кг; Pharmamagist Ltd., Венгрия). Препараты вводили внутримышечно, после чего скальпелем выполняли глубокий длинный (около 2 см) поперечный разрез кожи в области средней трети бедра правой нижней конечности без проведения антисептической обработки. После нанесения травмы животных возвращали в клетку, обезболивание не применяли. Образцы кожи получали после эвтаназии крыс путём передозировки наркоза на разных этапах заживления раны — спустя 12 ч, 24 ч, 1, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток после травматического воздействия. В качестве контроля использовали фрагменты кожи интактных крыс.

Исходы исследования

Основной исход исследования

С помощью иммуногистохимического метода с использованием антител к каспазе 3 и белку р53 удалось проследить динамику общего количества гибнущих клеток дермы и гиподермиса в перинекротической области на разных этапах раневого процесса. Установлено, что иммуногистохимическая реакция с антителами к фосфорилированному гистону Н3 демонстрирует высокую специфичность в отношении делящихся клеток в соединительных тканях дермы, но метод имеет функциональные ограничения. Статистическая обработка количественных данных позволила рассчитать пролиферативно-апоптотический индекс, который может быть использован в качестве критерия для определения фазы раневого процесса.

Методы регистрации исходов

Иммуногистохимическое исследование

При проведении иммуногистохимических реакций использовали: кроличьи поликлональные антитела к Н3S10ph (кат. № ab14955, Abcam, Великобритания; разведение 1:1200); мышиные моноклональные антитела к белку р53 (кат. № M700129-2, Dako, Дания; клон DO-7, разведение 1:200); кроличьи поликлональные антитела к каспазе 3 (кат. № A11021, ABclonal Biotechnology Co, Китай; разведение 1:700). Подготовку и окрашивание образцов проводили по следующей схеме:

• фрагменты кожи фиксировали в забуференном 10% растворе формалина в течение 24 часов;
• затем образцы перекладывали в 96% этиловый спирт и после поэтапной проводки заливали в парафин на пластиковых кассетах;
• парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали на санном микротоме (Sakura, Япония) и переносили на предметные стёкла, покрытые полилизином;
• готовые срезы просушивали в термостате при температуре 37 °С в течение 12 часов;
• далее препараты депарафинизировали в ксилоле, 10 мин;
• на следующем этапе срезы регидратировали в этиловом спирте — 2 раза по 5 мин в 96% этаноле и 1 раз в 80% этаноле, после чего промывали в дистиллированной воде, 5 мин;
• для демаскирования антигенов препараты погружали в предварительно нагретый до 60 °С буфер S1700 (Dako, Дания) и инкубировали в пароварке в течение 25 мин;
• срезы повторно промывали в дистиллированной воде в течение 5 мин и помещали в раствор пероксида водорода — 3% Н₂О₂, на 10 мин;
• препараты вновь промывали и выдерживали в фосфатно-солевом буфере PBS (Биолот, Россия), 5 мин;
• неспецифическое связывание вторичных антител блокировали в растворе Protein Block DP-125 (Spring Bioscience, США) при комнатной температуре, в течение 10 мин;
• после удаления блокирующего раствора наносили первичные антитела и инкубировали в термостате при температуре 27 °С при поддержании постоянной влажности (гистон Н3 — 48 ч, р53 – 1 ч, каспаза 3 – 20 мин);
• срезы промывали два раза в PBS;
• далее наносили вторичные антитела, конъюгированные с полимером и пероксидазой хрена и инкубировали во влажной камере при температуре 27 °С, 30–40 мин, после чего препараты снова промывали в PBS;
• наносили рабочий раствор 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида (Dako, Дания) и инкубировали в течение 3 мин для проявления реакции, под визуальным контролем с использованием микроскопа;
• после достижения нужной степени окраски срезы промывали в 3% Н₂О₂ и дистиллированной воде — 3 раза по 5 мин;
• препараты обезвоживали в изопропиловом спирте и смеси спирта с ксилолом (1:1);
• просветляли в ксилоле;
• ядра клеток докрашивали толуидиновым синим;
• готовые препараты заключали в среду Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific, США).

Для визуализации использовали световой микроскоп Zeiss Axio Scope A1 (Zeiss, Германия), оснащённый фотокамерой Zeiss Axiocam ERc 5s (Zeiss, Германия).

Морфометрическое исследование

Морфометрический анализ оцифрованных изображений проводили при помощи лицензионного программного обеспечения Zen 2.3. (Zeiss, Германия). Иммунопозитивные клетки подсчитывали на каждом препарате в автоматизированном режиме в 10 непересекающихся полях при помощи опции «Точки». Индекс пролиферации рассчитывали как процентное отношение числа клеток с иммунореактивными ядрами на 10 полях зрения к общему числу клеток. Пролиферативно-апоптотический индекс (ПАИ) рассчитывали по формуле:

$ПАИ=М/(aр+ас)$, (1)

где М — количество делящихся клеток, то есть количество клеток, связывающихся с антителами к фосфорилированному гистону Н3; ар — количество клеток в процессе апоптоза, реализующегося по митохондриальному пути, то есть количество p53-позитивных клеток; ас — количество клеток в процессе каспаза-зависимого апоптоза (каспаза 3-позитивных клеток). Числовые данные заносили в таблицы Excel (Microsoft, США) для построения графиков и дальнейшей статистической обработки.

Анализ в группах

Животных разделили на 9 групп: контрольная группа — интактные особи (n = 3); остальные группы соответствуют срокам после нанесения механической травмы кожи — 12 ч, 24 ч, 2, 3, 6, 10, 15 и 25 суток (n = 3 в каждой группе).

Статистический анализ

Запланированный размер выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программ Excel (Microsoft, США) и Statistica 10.0 (StatSoft, США). Тип распределения данных определяли при помощи критерия Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса. В случае нормального распределения использовали t-тест Стьюдента. Значения представляли в виде средней величины и стандартного отклонения. Если распределение отличалось от нормального, использовали U-критерий Манна–Уитни для двух групп (попарный анализ). Значимыми считали различия при р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристики выборки

Фрагменты кожи бедра самцов крыс линии Wistar на разных этапах заживления после нанесения механического повреждения — глубокой резаной раны. Образцы размером 1,5–2,0 см включали раневой канал и окружающие его неповреждённые ткани кожи (оценивали визуально).

Основные результаты исследования

В дерме экспериментальных животных всех групп обнаружены иммунопозитивные к фосфогистону Н3, каспазе 3 и р53 клетки (рис. 5). В контрольной группе индекс пролиферации в соединительных тканях кожи составил 2,60%. Через 12 ч после травмы этот показатель ниже на 94,6% и составляет 0,14%. В ходе раневого процесса количество делящихся клеток закономерно увеличивается и достигает максимальных значений к концу первых суток и на 6-е сутки эксперимента — индекс пролиферации 8,30% и 8,90% соответственно. Через 25 суток после травматического повреждения кожи индекс пролиферации составил 1,75%, что меньше, чем в контрольной группе на 32,7% (рис. 6). В коже интактных животных встречаются единичные клетки, иммунопозитивные к маркерам апоптоза: к каспазе 3 — 2,8±2,9 клетки; к белку р53 — 3,4±2,5 клетки. После механической травмы уже через 12 часов наблюдается повышение количества таких клеток. Первой пиковых значений достигает экспрессия белка р53: через 24 часа после повреждения количество иммунопозитивных клеток составляет 48,3±4,6 (p = 0,002 при сравнении с временной точкой 12 ч). Последующие «пики» экспрессии р53 приходятся на 3 и 15-е сутки эксперимента — 36,1±0,4 и 35,6±0,1 иммунопозитивных клеток на 10 полях зрения соответственно. Наименьшее количество клеток, экспрессирующих p53, выявлено через 2 и 6 суток после травмы — 14,4±0,2 и 14,6±0,2 клеток на 10 полях зрения соответственно. На 25-е сутки визуализируются единичные p53-позитивные клетки, количество которых сопоставимо со значением в интактной коже. Повышение экспрессии каспазы 3, по сравнению с показателями интактной кожи, обнаружено через 12 и 24 ч после начала эксперимента — 23,3±1,1 и 26,8±0,1 клеток на 10 полях зрения соответственно. Однако, значимое увеличение количества каспаза 3-позитивных клеток установлено только через 2-е суток после травмы (81,1±0,3 клеток; p = 0,02 при сравнении с группой 24 ч), а абсолютный максимум пришёлся на 10-е сутки эксперимента (90,3±1,2 клеток; р = 0,05 при сравнении с группой 6 суток). Необходимо отметить, что общее количество клеток, экспрессирующих каспазу 3, превышает количество р53-иммунопозитивных клеток во всех временных точках (рис. 7). Исследование перинекротической области кожной раны показало, что процессы клеточной гибели на начальных этапах посттравматического гистогенеза преобладают над пролиферативными и отличаются от контроля (см. рис. 7). В то же время количество клеток, находящихся в начальной фазе митоза, свидетельствует о резком снижении интенсивности пролиферации в первые часы после ранения и её статистически значимом повышении (p = 0,003) уже к концу первых суток эксперимента (см. рис. 6).

Рис. 5. Кожа бедра крысы спустя 6 суток после нанесения травмы — перинекротическая область: a — иммуногистохимическая реакция с антителами к фосфогистону Н3; b — иммуногистохимическая реакция с антителами к каспазе 3; c — иммуногистохимическая реакция с антителами к р53. Стрелками указаны иммуноположительные клетки; объектив ×40, окуляр ×10.

Fig. 5. Rat thigh skin 6 days after injury, perinecrotic zone: a, immunohistochemistry with antibodies to phospho-histone H3; b, immunohistochemistry with antibodies to caspase-3; c, immunohistochemistry with antibodies to p53. Arrows indicate immunopositive cells; objective lens ×40, eyepiece lens ×10.

Рис. 6. Динамика индекса пролиферации клеток соединительных тканей кожи в перинекротической области в зависимости от фазы раневого процесса.

Fig. 6. Changes in the proliferation to apoptosis ratio of cutaneous connective tissue cells in the perinecrotic zone depending on the wound healing phase.

Рис. 7. Динамика количества клеток, экспрессирующих белок р53 и каспазу 3 (casp 3) в зависимости от фазы раневого процесса.

Fig. 7. Changes in the number of cells expressing p53 and caspase-3 (casp 3) depending on the wound healing phase.

Известно, что тканевой гомеостаз регулируется соотношением процессов пролиферации и апоптоза в клетках, поэтому сравнительный анализ этого показателя может служить значимым диагностическим критерием. Рассчитанный по формуле 1 индекс ПАИ (рис. 8) комплексно отражает соотношение делящихся и гибнущих клеток в исследуемой ткани. Наименьшее значение ПАИ является следствием высокого уровня апоптоза и низкой скорости образования новых клеток (пролиферации). Установлено, что наибольшую величину ПАИ (2,25) демонстрируют образцы интактной кожи. В первые часы после травмы показатель резко падает: ПАИ = 0,02 через 12 ч и 0,05 через 24 часа. По мере развития процессов регенерации индекс, отражающий баланс между пролиферацией и апоптозом, постепенно увеличивается и достигает наибольшего значения через 6 суток после травмы, тогда как на 10 и 15 сутки ПАИ снова снижается до 0,20. Вероятно такая динамика индекса связана с отсроченной гибелью клеток в перинекротической области раны. К 25-м суткам регенерационного гистогенеза значение ПАИ стремится к условно нормальному показателю и составляет 1,45 (см. рис. 9).

Рис. 8. Динамика количества пролиферирующих и гибнущих клеток в разные сроки после травмы кожи.

Fig. 8. Changes in the number of proliferating and dying cells at different time points after skin injury.

Рис. 9. Динамика пролиферативно-апоптотического индекса в зависимости от фазы раневого процесса.

Fig. 9. Changes in the proliferation to apoptosis ratio depending on the wound healing phase.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме результатов исследования

Для оценки течения раневого процесса мы предприняли попытку проследить изменения соотношения процессов пролиферации и апоптоза при заживлении механического повреждения кожи в эксперименте. В работе использовали иммуногистохимический метод с последующей статистической обработкой результатов и проведением математических вычислений. Раздельный анализ индекса пролиферации и показателя апоптотической гибели клеток на разных этапах регенерации позволил нам проследить динамику этих процессов и вывести формулу для расчёта пролиферативно-апоптотического индекса. Значения ПАИ в коже интактных крыс приняли за «условно нормальные». Результаты сравнения индексов на разных этапах регенерации подтверждают, что данный показатель отражает характерные для фаз раневого процесса изменения гомеостаза и может служить диагностическим критерием. Однако специфика иммуногистохимического маркера для выявления пролиферации (фосфогистона Н3) не позволяет в полной мере оценить количество делящихся клеток, поскольку он экспрессируется только в клетках, находящихся в поздней G2- и начальной М-фазах клеточного цикла. В связи с этим, для объективной оценки количества пролиферирующих клеток целесообразно использовать дополнительные маркеры.

Обсуждение основных результатов

В работах некоторых авторов использованы математические методы определения пролиферативно-апоптотического соотношения в тканях со злокачественными новообразованиями [16]. Взяв эти методы за основу, мы вывели простую формулу для определения пролиферативно-апоптотического соотношения в соединительных тканях, что позволило проследить динамику этого показателя на разных этапах регенерации (рис. 9). Предлагаемый нами подход является принципиально новым методом определения индекса, характеризующего гомеостаз соединительных тканей кожи в постраневом гистогенезе.

Для физиологической регенерации кожи характерно преобладание пролиферативных процессов над клеточной гибелью, что в нашем исследовании подтвердилось высоким значением пролиферативно-апоптотического индекса в коже интактных животных контрольной группы. Первые часы после механической травмы характеризуются развитием системной воспалительной реакции, которая проявляется значительным увеличением уровня клеточной гибели на фоне угнетения пролиферативных процессов. Эта реакция нашла отражение в величине пролиферативно-апоптотического индекса, который значимо ниже по сравнению с контрольной группой. Известно, что после травмы регенерационный гистогенез, следующий за воспалительной реакцией, характеризуется активной пролиферацией клеток [17]. В настоящем исследовании мы наблюдали отчётливую динамику ПАИ — до 6 суток после травмы индекс повышается. Дальнейшее заживление раны характеризуется постепенным увеличением общего количества клеток в зоне повреждения, как за счёт их миграции из прилежащих тканей, так и путём продолжающейся пролиферации резидентных клеток. На этом фоне наблюдается временное увеличение уровня маркеров клеточной гибели, что объясняется отсроченной гибелью тканевых структур и выражается в снижении ПАИ в период с 10 по 15 сутки эксперимента. При этом в указанные сроки ПАИ в 10 раз превышает значения показателя в первые сутки после травмы.

Несмотря на то, что у части животных регенерация тканей визуально полностью завершается к 25-м суткам эксперимента, необходимо учитывать индивидуальные особенности течения процессов заживления. К концу эксперимента индекс пролиферации ниже, чем в нулевую фазу регенерации (в коже интактных крыс), однако показатели апоптоза сопоставимы с таковыми в контрольной группе. Предложенный нами индекс отражает подобные изменения соотношения пролиферации и апоптоза и на 25-е сутки эксперимента существенно превышает значения в предыдущих временных точках, однако остаётся на 35,6% ниже контрольного показателя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании предложен индекс, отражающий соотношение пролиферации и апоптоза в клетках соединительных тканей кожи в посттравматическом периоде и позволяющий комплексно охарактеризовать динамику данных процессов. Мы предполагаем, что ПАИ можно рассматривать в качестве критерия для определения фазы регенерационного гистогенеза. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уровень апоптоза, реализующегося по митохондриальному и каспаза-зависимому механизмам, возможно определить с помощью комбинации маркеров р53 и каспазы 3. Однако учитывая особенности экспрессии использованного маркера фосфогистона Н3, для более объективной оценки пролиферативной активности необходимо продолжить исследования. Рассчитанный нами индекс или аналогичные показатели клеточного баланса в тканях могут использоваться для своевременной классификации ран. Возможно, именно такие критерии позволят объективно определять неблагоприятное течение раневого процесса и предотвращать преобразование острых ран в хронические.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Т.И. Березовская — определение концепции, работа с данными, анализ данных, проведение исследования, обеспечение исследования, валидация, визуализация, написание черновика рукописи, пересмотр и редактирование рукописи; И.А. Одинцова — руководство исследованием, адмнистрирование проекта, разработка методологии, определение концепции, валидация. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Условия содержания экспериментальных животных соответствовали принципам биоэтики и «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Хельсинкская декларация, 2000 г.), закону «О защите животных от жестокого обращения» (глава V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.), приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г., а также приказу МЗ РФ от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Протокол проведения исследований одобрен комиссией независимого локального этического комитета ФГБОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Выписка из протокола заседания Локального этического комитета от 17.10.2023 г. (протокол № 283).

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: T.I. Berezovskaya: conceptualization, data curation, formal analysis, investigation, resources, validation, visualization, writing—original draft, writing—review & editing; I.A. Odintsova: supervision, project administration, methodology, conceptualization, validation. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: Experimental animal housing complied with the principles of bioethics and the “Rules for Working with Experimental Animals” (Declaration of Helsinki, 2000), the Federal Law of the Russian Federation “On the Protection of Animals from Cruelty” (Chapter V, Article 104679-GD, December 1, 1999), Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 267 of June 19, 2003, and Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 199n of April 1, 2016, “On Approval of the Rules of Good Laboratory Practice.” The study protocol was approved by the Independent Local Ethics Committee of the S.M. Kirov Military Medical Academy. Extract from the minutes of the meeting of the Local Ethics Committee (Minutes No. 283, dated October 17, 2023).

Funding sources: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the Editorial Board, and the in-house scientific editor.

About the authors

Tatyana I. Berezovskaya

Author for correspondence.
Email: lapi2@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0009-1591-9152
SPIN-code: 2508-7042
Russian Federation, Saint Petersburg

Irina A. Odintsova

Email: odintsova-irina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0143-7402
SPIN-code: 1523-8394

Dr. Sci. (Medicine), Professor

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Intact rat thigh skin: hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Download (317KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Rat thigh skin 2 days after injury: black arrow, wound channel; dashed arrow, zone of primary necrosis; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Download (349KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Rat thigh skin 6 days after injury: black arrows, zone of primary necrosis; dashed arrows, perinecrotic zone; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Download (501KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Rat thigh skin 10 days after injury: perinecrotic zone; hematoxylin and eosin staining; objective lens ×4, eyepiece lens ×10.

Download (496KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Rat thigh skin 6 days after injury, perinecrotic zone: a, immunohistochemistry with antibodies to phospho-histone H3; b, immunohistochemistry with antibodies to caspase-3; c, immunohistochemistry with antibodies to p53. Arrows indicate immunopositive cells; objective lens ×40, eyepiece lens ×10.

Download (456KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Changes in the proliferation to apoptosis ratio of cutaneous connective tissue cells in the perinecrotic zone depending on the wound healing phase.

Download (134KB)

Indexing metadata

8. Fig. 7. Changes in the number of cells expressing p53 and caspase-3 (casp 3) depending on the wound healing phase.

Download (132KB)

Indexing metadata

9. Fig. 8. Changes in the number of proliferating and dying cells at different time points after skin injury.

Download (170KB)

Indexing metadata

10. Fig. 9. Changes in the proliferation to apoptosis ratio depending on the wound healing phase.

Download (114KB)

Indexing metadata