REACTIVE MICROGLIAL CHANGES IN RAT NEOCORTEX AND HIPPOCAMPUS AFTER EXPOSURE TO ACUTE PERINATAL HYPOXIA

Full Text

В пренатальный период развития микроглиоциты, в отличие от других типов клеток глии, довольно рано появляются в головном мозгу человека и животных. Известно, что микроглия, в зависимости от функционального состояния, может иметь разный фенотип и в соответствии с ним обладать различными свойствами. В развивающейся ЦНС отмечена неодинаковая плотность популяции микроглиоцитов в отдельных формациях мозга, которая может меняться на разных стадиях развития. Показано, что микроглия участвует в структурной организации мозга, в регуляции ангиогенеза [4, 9, 10], стимуляции аксонального роста, при этом она обладает фагоцитарными и иммунологическими свойствами [2, 5, 11]. Существует предположение, что микроглии принадлежит особая роль при развитии пренатальной патологии, в частности, значительное увеличение численности активированных микроглиоцитов в областях головного мозга может приводить к продолжительному высвобождению реактивных ионов кислорода и азота, вызывающих оксидативный стресс в развивающихся отделах мозга и способствующих усугублению повреждения [3, 12]. Несмотря на имеющиеся факты о разнообразных свойствах микроглии, относительно немного известно о роли, появлении, миграции и трансформации микроглиоцитов в мозгу новорожденных млекопитающих и человека при воздействии неблагоприятных факторов в период, когда возможно формирование перинатальной нейропатологии. Поэтому цель данной работы — изучить динамику реактивного изменения плотности популяции микроглиоцитов, обратимости их фенотипических форм в мозгу новорожденных крыс в разные сроки после воздействия острой нормобарической гипоксии. Материал и методы. Воздействие гипоксии на головной мозг новорожденных крысят осуществляли в барокамере СВК-150 (собрана в ИЭФБ, Санкт-Петербург, Россия), оснащенной устройством для автоматически управляемого обогрева, смены газовой смеси и определения скорости потока газа. Азотно-кислородную газовую смесь готовили с помощью газосмесительной установки (Laorg, Франция). Подопытных животных помещали в барокамеру на 1 ч. Во время экспериментов содержание кислорода в барокамере составляло 7,6–7,8%; углекислого газа — 0,15–0,21%; температура — 21,3–23 °С при нормальном атмосферном давлении. Были использованы 3 группы животных: 1-ю группу составили крысята, подвергавшиеся в барокамере воздействию гипоксии (экспериментальная группа); 2-ю группу — животные, содержавшиеся в барокамере при нормальных условиях (содержание кислорода в воздухе 21–22%, температуре — 21–23 °С и нормальное давление) (контрольная группа) и 3-ю группу — интактные животные, того же возраста (2-я контрольная группа). В каждой группе на одну временную точку приходилось по 8–10 крысят. Воздействие гипоксии осуществляли на 2-е постнатальные сутки. Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Гистологическое исследование разных областей неокортекса (фронтальной, моторной, соматосенсорной и зрительной областей) и отделов гиппокампа (СА1, СА3, СА4) проводили через 1 и 3 ч, 1 и 5 сут после воздействия гипоксии. Головной мозг фиксировали в смеси 96° этилового спирта, формалина и хлорида цинка [1]. Материал по общепринятой методике заливали в парафин, готовили серийные фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые после депарафинирования окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля. Микроглиоциты выявляли иммуноцитохимически с помощью поликлональных козьих антител к антигену Iba-1 (AbCam, Великобритания) в разведении 1:320. Для выявления комплекса антиген—антитело применяли набор реагентов LSAB+ (Dako, Дания). Визуализацию продукта реакции проводили при помощи хромогена DAB+ (Dako, Дания). После проведения реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Джалоли. Для компьютерной морфометрии использовали гистологические фронтальные срезы головного мозга. С помощью цифровой камеры, встроенной в микроскоп, получали изображения, на которых при помощи программы ImageJ (США) на 10 серийных гистологических срезах (на каждом 3-м срезе) у животных экспериментальной и контрольных групп подсчитывали число клеток на единице площади, которая была равна 0,105 мм². Определяли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку. Статистическую обработку полученных морфометрических показателей осуществляли при помощи компьютерных программ ImageScope Color и ORIGIN50. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Морфологические исследования проводили при помощи светового микроскопа DME (Leica, Германия), изображения были получены при помощи цифровой видеокамеры EC3 (Leica, Германия). Результаты исследования. У животных двух контрольных групп различий обнаружено не было. В ранний перинатальный период (2-е сутки после рождения) в их головном мозгу микроглиоциты представлены тремя общеизвестными морфологически различимыми формами: амебоидной (с округлой или овальной формой клеточного тела), ветвящейся (с небольшим ободком цитоплазмы вокруг ядра и длинными ветвящимися отростками; клетки могут быть полигональными с несколькими отростками, веретеновидными с двумя отростками или с одним ветвящимся отростком) и переходной, или промежуточной (с большим объемом цитоплазмы и короткими отростками). У контрольных крыс на 2-е постнатальные сутки микроглиоциты амебоидной формы выявляются преимущественно в субвентрикулярной зоне и вдоль крупных сосудов. Одиночные микроглиоциты ветвящейся формы встречаются между пирамидными нейронами в слоях разных полей гиппокампа и неокортекса. Исследование показало, что после воздействия острой гипоксии как в гиппокампе, так и в неокортексе, происходит одновременное появление апоптотически погибших клеток и синхронное увеличение плотности популяции микроглиоцитов. Через 1 ч после воздействия гипоксии в неокортексе (фронтальной, моторной, соматосенсорной и зрительной областях) отмечены единичные погибшие клетки. В гиппокампе, в полях СА1, СА3, СА4, так же как и в неокортексе, обнаруживаются единичные апоптотические тельца. В это же время имеет место увеличение плотности популяции микроглиоцитов амебоидной и переходной форм по сравнению с таковой в контроле в гиппокампе в молекулярном слое и лакунарном подслое (29,3±2,8 и 12±4) и неокортексе (10,8±2,4 и 1,50±0,21). При этом микроглиоциты практически исчезают в субвентрикулярной зоне (рисунок, а), сохраняются лишь единичные клетки, в основном веретеновидной формы с двумя ветвящимися отростками. Через 3 ч после воздействия гипоксии в исследованных областях неокортекса апоптотические тельца встречаются в верхних слоях (II и III), однако, как и в предыдущий срок исследования гибель клеток небольшая (3–4 клетки в поле зрения при об. 20). В гиппокампе в поле СА3 наблюдается увеличение количества погибших клеток (до 11–12 клеток в поле зрения при об. 20), в то время как в полях СА1 и СА4 погибшие клетки остаются единичными. В вентрикулярной и субвентрикулярной зонах, вокруг крупных сосудов и вдоль проводящих путей плотность популяции микроглиоцитов вновь увеличивается (см. рисунок, б), их большая часть представлена амебоидной формой. Через 1 сут после воздействия гипоксии в верхних слоях (II и III) исследованных областей неокортекса и в полях СА1 и СА3 гиппокампа имеет место увеличение числа клеток, погибающих путем апоптоза (в 2–3 раза по сравнению с таковым в предыдущий срок исследования). В поле СА3, наряду с апоптотическими тельцами, присутствуют нейроны с признаками отчетливо выраженного гиперхроматоза. В это же время практически во всех отделах головного мозга отмечено повышение численности микроглиоцитов. В гиппокампе в полях СА1, СА3, в молекулярном слое и лакунарном подслое, а также в слоях неокортекса количество микроглиоцитов значительно превышает таковое в контроле (19,8±2,8 и 2,0±0,1; 22±3 и 4,8±1,8; 32±3 и 12±4; 20,1±1,2 и 2,8±0,3 соответственно), при этом большинство из них — переходной формы. В вентрикулярной и субвентрикулярной зонах присутствуют как амебоидные, так и ветвящиеся микроглиоциты (веретеновидные с одним или двумя ветвящимися отростками). Через 5 сут после воздействия гипоксии в исследованных структурах мозга также присутствуют апоптотические тельца, свидетельствующие о продолжающейся гибели клеток, при этом в неокортексе, особенно во II и III слоях, их количество было значительным (см. рисунок, д). Наряду с этим, сохраняется довольно высокая плотность диффузно рассеянных микроглиоцитов во всех изученных областях головного мозга: в полях СА1, СА3, в молекулярном слое и лакунарном подслое, а также в неокортексе по сравнению с контролем (14,0±1,8 и 7,0±1,3; 30,4±2,4 и 2,2±0,3; 45,0±2,9 и 18,3±2,1; 34±4 и 12,0±1,8 соответственно), как правило, преобладает переходная и ветвящаяся их форма (см. рисунок, в, г). Амебоидные микроглиоциты обнаруживаются в субвентрикулярной зоне рядом с крупными сосудами и вдоль проводящих путей. У контрольных животных в этот срок постнатального развития микроглиоцитов значительно меньше. Небольшие скопления амебоидных микроглиоцитов отмечены в субвентрикулярной зоне, рядом с крупными сосудами и вдоль проводящих путей, а немногочисленные ветвящиеся микроглиоциты диффузно рассеяны в гиппокампе в слоях пирамидном, молекулярном и лакунарном подслое и иногда в субвентрикулярной зоне. Обсуждение полученных данных. В настоящее время установлено, что амебоидные микроглиоциты являются активированной формой, в цитоплазме которых содержится значительное количество гидролитических ферментов. Эти микроглиоциты мобильны, быстро реагируют на разного рода повреждения и инфекцию, а также являются предшественниками ветвящейся формы, которая, в свою очередь, представляет микроглиоциты, находящиеся в состоянии покоя. Процессы трансформации амебоидных микроглиоцитов в ветвящиеся являются обратимыми, включая переходную ее форму [6–8, 11]. Результаты проведенного исследования показали, что реакция микроглии на воздействие острой гипоксии в неокортексе и гиппокампе у новорожденных развивается постепенно и синхронно с увеличением клеточной гибели. Уже через 1 ч после гипоксии отмечена апоптотическая гибель клеток в неокортексе и гиппокампе, которая усиливается к концу 1-х суток после воздействия гипоксии. Одновременно в этих формациях происходит увеличение плотности популяции микроглиоцитов, в основном амебоидной формы. Вероятно, это происходит в результате их миграции из субвентрикулярной зоны и областей, прилежащих к крупным сосудам, откуда они (через 1 ч) практически исчезают, и там остаются единичные ветвящиеся микроглиоциты. Однако довольно быстро (через 3 ч) популяция амебоидных микроглиоцитов восстанавлявается. Через 1 сут после воздействия гипоксии с увеличением клеточной гибели активность микроглии повышается, о чем может свидетельствовать увеличение плотности активной амебоидной формы микроглиоцитов практически во всех отделах головного мозга. Повышенная численность популяции микроглиоцитов (всех форм) сохраняется и через 5 сут после воздействия гипоксии, так как в это время имеет место отсроченная клеточная гибель, особенно в неокортексе. Здесь микроглия представлена преимущественно переходной и ветвящейся формами микроглиоцитов. Несмотря на то, что продолжают накапливаться данные о роли и функциях микроглиоцитов, механизм, с помощью которого они появляются в ЦНС, до сих пор до конца не ясен. Существует предположение, что микроглиоциты могут проникать в мозг через стенки кровеносных сосудов в герминативном слое, мигрируя из него в вентрикулярную, субвентрикулярную зоны, в гиппокамп, мозолистое тело и затем в неокортекс, передвигаясь по трактам белого вещества, вдоль радиальных глиоцитов и сосудистой сети [2]. Наши данные подтверждают это предположение, так как пополнение популяции микроглиоцитов регистрируется именно в этих зонах. Показано, что в пренатальный период у плодов человека и грызунов микроглия в активированной форме первоначально выявляется в герминативном слое, затем вентрикулярной и субвентрикулярной зонах [11, 13]. Учитывая перечисленные выше факты, можно предположить, что как в пре-, так и в постнатальный период развития существует один механизм появления микроглии в ЦНС.

About the authors

L. I. Khozhai

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: astarta0505@mail.ru

V. A. Otellin

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

References

Supplementary files