MORPHOLOGICAL PECULIARITIES OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN ARCTIC FOXES AFTER ADMINISTRATION OF VARIOUS DOSES OF VITAMINS A AND E

Full Text

Новейшие технологии значительно расширили рамки морфологических исследований в гематологии. В частности, определение морфометрических параметров — конфигурации и размеров клеточных структур имеет большое значение для оценки функциональной активности лейкоцитов и характера распределения популяций клеток при диагностике и мониторинге заболеваний и выявлении влияния факторов внешней среды на организм [5]. Как известно, биологически активные соединения, в том числе витамины, влияют на иммунную систему. На моделях с использованием животных и в культуре показано, что витамин А и родственные ретиноиды участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и функций кроветворных и иммунокомпетентных клеток [12, 15]. Установлено, что витамин Е является необходимым компонентом мембран клеток и субклеточных структур и, обладая антиоксидантной и антиапоптотической активностью, он в значительной степени обеспечивает их структурнофункциональную стабильность [10, 15]. Цель настоящей работы — изучение влияния различных доз витаминов А и Е на морфометрические параметры и особенности поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови у вуалевых песцов. Материал и методы. Исследования выполнены с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования Института биологии Карельского научного центра РАН. Работа проведена на 6-месячных самках песцов, содержавшихся на звероводческой ферме Республики Карелия. Животные были разделены на 5 групп по 6 особей в каждой: контрольную, которая находилась на обычном рационе, и 4 подопытных, получавших дополнительно витаминыАили Е. Животным 1-й подопытной группы добавляли в рацион 5000 МЕ, 2-й — 10 000 МЕ масляного раствора витамина А (ретинола ацетата) в сутки. Животные 3-йи 4-й групп получали в сутки соответственно по 50 и 100 мг витамина Е [dl-α-токоферилацетат, куксавит E 50 (Lohman Animal Health, Германия)]. В звероводстве общепринятые дозы составляют: витамина А — 500 МЕ и витамина Е — 15 мг/сут. Кровь песцов брали без наркоза, утром натощак из плантарной вены, в объеме 3 мл. На мазках, окрашенных по Паппенгейму, исследовали морфологические особенности лимфоцитов и определяли их относительное содержание. В работе использовали световой микроскоп Axioscop 40 (Carl Zeiss, Германия) с цветной цифровой видеокамерой (Pixera 150ES) и компьютерной системой анализа изображений «Видеотест». Морфометрические параметры — площадь лимфоцита, доля площади, занимаемая ядром, фактор формы круга и фактор формы эллипса определены у 1454 относительно гладких форм лимфоцитов и 96 — с выростами и сфероидными образованиями у всех животных. Кроме морфологического анализа, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сыворотке крови определяли концентрацию ретинола и α-токоферола. Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ MS Exel и Statgraphics общепринятыми методами вариационной статистики. Оценку значимости различий показателей проводили с применением критериев Вилкоксона—Манна—Уитни и Стьюдента. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Результаты исследования. Данные об относительном содержании и морфометрических параметрах лимфоцитов периферической крови песцов представлены в табл. 1, 2 и на рис. 1. Установлено, что лимфоцитарная популяция у вуалевых песцов состоит в основном из округлых и эллипсовидных клеток среднего размера, мелкие лимфоциты с широким ободком цитоплазмы и гранулами встречаются редко. Большинство лимфоцитов имеют относительно гладкую поверхность (рис. 2, а) и только у некоторых наблюдаются едва видимые ворсинчатые образования (см. рис. 1, б) или различной величины выросты и сфероидные выпячивания (см. рис. 1, в–е). Лимфоциты с цитоплазматическими выпячиваниями приобретают пузырчатый вид с более отчетливо выраженной базофилией периферической части цитоплазмы. Количество выростов и сфероидных образований колеблется от 1 до 6 на один лимфоцит, и они составляют в среднем от 0,73 до 8,95% от общей площади клетки. Размеры лимфоцитов с выростами и сфероидными образованиями, за незначительным исключением, больше, чем у относительно гладких форм. По величине параметров, характеризующих форму клеток, этот тип лимфоцитов близок к эллипсу, причем цитоплазматические выпячивания увеличивают неровность периметра. Фактор формы круга у них колеблется в среднем от 0,790 до 0,825 отн. ед., фактор формы эллипса — от 0,985 до 0,993 отн. ед. Ядра лимфоцитов обычно округлые или овальные, иногда — с небольшой выемкой. Значительных различий формы и размера ядра в зависимости от рельефа поверхности клетки не выявлено. Однако, как правило, за счет выростов изменяется ядерно-цитоплазматическое отношение в сторону увеличения площади цитоплазмы лимфоцитов и, соответственно, уменьшения доли площади, занимаемой ядром. Дополнительный прием витамина А, как показал хроматографический анализ, вызывает существенное возрастание концентрации ретинола в сыворотке крови, при нагрузке витамином Е изменения в содержании токоферола отсутствуют. Добавка в рацион песцов больших доз витаминов А и Е приводит к изменению параметров лимфоцитов, но не влияет на их относительное содержание в периферической крови (см. табл. 2). Морфометрические параметры лимфоидных клеток и их ядер у всех подопытных животных в большинстве случаев меньше, чем в контроле. В крови песцов в содержании лимфоцитов со сфероидными образованиями значимых различий между исследованными группами не выявлено. Однако у животных, находящихся на рационе с добавкой витамина А, частота встречаемости их больше, и предел колебаний составляет от 0 до 12,5% (см. табл. 2). Возможно, это связано с повышением содержания ретинола в сыворотке крови. У животных из группы с витамином Е аналогичное изменение строения лимфоцитов наблюдается так же, как и у контрольных, в единичных случаях, а их количество колеблется от 0 до 1,5%. Лимфоциты у животных контрольной группы и содержавшихся на рационах с витамином Е представлены преимущественно относительно гладкими формами, тогда как у получавших витамин А частота встречаемости клеток с выростами и сфероидными образованиями увеличена. Обсуждение полученных данных. Известно, что лимфоциты имеют сферическую форму и различаются между собой по размерам и характеру клеточной поверхности. Параметры лимфоцитов у песцов, установленные нами на мазках крови, отличаются от таковых у других видов животных, что, по-видимому, обусловлено не только видовыми особенностями, но и, как показано в некоторых работах, способом фиксации и методами визуализации [1, 9, 11]. В настоящее время электронно-микроскопическими исследованиями выявлены полиморфизм клеточной поверхности форменных элементов крови, а также изменения ее при экспериментальных воздействиях и при различных физиологических состояниях организма и патологии [5, 7, 8]. В зависимости от микрорельефа поверхности, исследованном на электронно-микроскопическом уровне, лимфоциты подразделяют на несколько групп — относительно гладкие, с выростами (фибриллярными, ламеллярными, бульбарными) и углублениями [5, 7]. По результатам нашего исследования под световым микроскопом лимфоциты крови песцов в основном представлены относительно гладкими формами, реже — с цитоплазматическими выпячиваниями и в единичных случаях — с очень трудно различимыми нитевидными структурами. Согласно литературным данным, ворсинки не прокрашиваются и не видны на светооптическом уровне, но наблюдаются при исследовании методами фазово-контрастной и атомно-силовой микроскопии [1, 2]. У песцов из общей популяции лимфоцитов по характеру рельефа выделяются клетки с одним или несколькими довольно большими цитоплазматическими выпячиваниями на поверхности. Исходя из морфологических признаков и по аналогии с электронно-микроскопическими исследованиями [5], мы отнесли их в группу лимфоцитов, содержащих выросты и сфероидные образования. Морфометрический анализ показал, что форма лимфоцитов со сложной конфигурацией поверхности в большей мере приближена к эллипсовидной, чем основного типа — относительно гладких. Цитоплазматические выросты, за некоторым исключением, приводят к увеличению размера лимфоцитов, что, возможно, отражает наличие запаса клеточного объема и возможности его регуляции [8, 9]. Плазмолемма является одной из наиболее чувствительных структур клетки и в значительной степени определяет её функциональную активность [5, 7]. Если в покое лимфоциты имеют относительно гладкую поверхность, то при активации и повреждении отмечено появление различных морфологических типов. Обнаружено, что архитектоника лимфоцитов изменяется при патологии, причем при некоторых состояниях увеличивается количество клеток со сфероидными образованиями, что коррелирует с усилением Т-клеточного пролиферативного ответа [7]. Отсутствие влияния добавки в рацион песцов витаминов А и Е на общее количество лимфоцитов, возможно, связано преимущественно с регуляцией продукции и функций отдельных типов лейкоцитов. В частности, в некоторых экспериментах показано, что витамин А вызывает увеличение активности естественных киллеров и освобождение супероксид-аниона нейтрофилами, а витамин Е способствует редукции супероксиданиона и ослаблению биоцидности лейкоцитов. Кроме того, выявлено, что действие витаминов зависит от ряда факторов, таких как состояние организма, наличие патологии, возраст, доза и продолжительность введения [15]. У животных, получавших витамины, смещение кривых распределения лимфоцитов по площади в сторону снижения отражает, по-видимому, изменение внутрипопуляционного соотношения лимфоцитов в крови. В некоторых работах отмечено стимулирующее влияние бета-каротина, являющегося предшественником витамина А, на рост тимуса и количество малых лимфоцитов [13]. Уменьшение площади и нарушение структуры плазмолеммы эритроцитов выявлено при экспериментальном гипервитаминозе А у самцов крыс линии Вистар [6]. Изменение строения лейкоцитов при действии ретиноидов было установлено в экспериментах с нейтрофилами человека. Обнаружено, что при их инкубации с транс-ретиналем и в меньшей степени с другими ретиноидами наблюдается образование многочисленных выростов клеточной поверхности и выделение супероксид-аниона [12]. Исходя из данных литературы, следует, что способность клетки сохранять определенную форму зависит от состояния и взаимодействия плазмолеммы и цитоскелета, изменения которых сопровождаются метаболическими и структурно-функциональными перестройками [3, 4]. Установлено, что формирование цитоплазматических очаговых вздутий, так называемый блеббинг, сопровождает апоптоз или некроз [4]. В исследованных нами образцах крови песцов признаков апоптоза и отделения клеточных фрагментов в межклеточную среду, как правило, не наблюдалось. Учитывая результаты наших исследований и имеющиеся данные литературы, можно предположить, что изменение рельефа клеточной поверхности лимфоцитов у животных, содержавшихся на рационах с большими дозами витамина А, может быть связано с действием ретинола на плазмолемму. Проявлением мембранотропного действия является увеличение количества лизосомальных энзимов в сыворотке и лейкоцитах крови кроликов после инъекций ретинола [14]. В наших экспериментах влияние витамина А на рельеф поверхности лимфоцитов обнаружено не у всех исследованных животных, что свидетельствует об индивидуальной чувствительности. Кроме индивидуальных, по-видимому, имеются и видовые различия, обусловленные особенностями метаболизма, соотношением про-, антиоксидантных и ряда других факторов, обеспечивающие адаптацию животных к среде обитания. В частности, имеются сведения о неодинаковой чувствительности к ретиноидам нейтрофилов у морской свинки и человека [12]. Реакция на добавки витаминов может определяться экологическими особенностями вида — дикого голубого песца, из которого была селекционирована вуалевая порода. Таким образом, в периферической крови вуалевых песцов большинство лимфоцитов представлено относительно гладкими формами, и незначительное их количество имеют выросты и сфероидные образования. Большие дозы витаминов А и Е вызывают существенное снижение площади лимфоцитов с относительно гладкой поверхностью и их ядер. Частота встречаемости лимфоцитов с изменениями микрорельефа у животных, находящихся на рационах с добавлением витамина А, увеличивается по сравнению с таковой у контрольных и получавших витамин Е. Различия в строении и изменении параметров могут быть обусловлены влиянием больших доз витаминов А и Е на структурно-функциональное состояние мембран и зависеть от вида животных.

About the authors

L. B. Uzenbayeva

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

I. V. Baishnikova

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

Email: iravbai@mail.ru

A. G. Kizhina

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

T. N. Ilyina

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

V. A. Ilyukha

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

N. N. Tyutyunnik

Institute of Biology Karelian RAS Research Center; Petrozavodsk State University

References

Supplementary files