MORPHOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE THYMUS DURING CHEMICAL CARCINOGENESIS INDUCED BY 1,2-DIMETHYLHYDRAZINE ADMINISTRATION

Full Text

Иммунная система и растущая опухоль находятся в сложных многоуровневых взаимодействиях, изучение и понимание которых открывают новые подходы к терапии [7]. Иммунотерапия опухолей в настоящее время является одним из перспективных направлений в онкологии. Синтезированы и успешно апробированы в клинике ряд моноклональных противоопухолевых антител. При некоторых опухолях эти соединения существенно повышают эффективность лечения и выживаемость пациентов даже в запущенных стадиях, а также при неэффективности классической химиотерапии [5, 6]. Рост злокачественных новообразований зачастую сопровождается продукцией ими веществ, угнетающих защитные силы организма. Это, в свою очередь, приводит либо к снижению, либо к полному блокированию противоопухолевого иммунного ответа [16]. При этом опухоль перестает распознаваться клетками иммунной системы как чужеродная или дефектная ткань и становится биологически более агрессивной. Кроме подавления локального иммунного ответа, опухоль обладает прямым угнетающим влиянием на иммунные органы, что приводит к снижению продукции ими иммунокомпетентных клеток либо к выработке дефектных цитотоксических лимфоцитов, которые также могут служить источником происхождения иммуносупрессивных T-regклеток [9]. Тимус является важным звеном иммунной защиты, функция которого направлена на поддержание пула периферических Т-лимфоцитов. Однако он, как никакой другой орган иммунной системы, подвержен инволютивным процессам, в том числе на фоне роста злокачественной опухоли [4]. Атрофия тимуса сопровождается перестройкой архитектоники долек, уменьшением объема паренхимы, замещением ее жировой и волокнистой соединительной тканями, а также снижением способности тимуса к выработке периферических наивных CD4+-и CD8+-тимоцитов. В конечном итоге это приводит к снижению иммунной и противоопухолевой защиты организма [2, 10]. В этой связи изучение клеточных и молекулярных механизмов инволюции тимуса на фоне развития злокачественной опухоли необходимо для создания целостного представления о канцерогенезе, что в дальнейшем позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторирования и лечения злокачественных новообразований. Цель настоящей работы - гистологический и иммуногистохимический анализ тимуса через 5 мес после введения канцерогена. Материал и методы. Работа выполнена на 50 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Животных содержали в виварии, уход за ними осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные были разделены на 2 группы: интактного контроля (20 крыс) и подопытную с внутрибрюшинным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 нед (30 крыс) в соответствии с моделью индукции опухолей толстой кишки R. F. Jacoby и соавт. [12]. Выведение из эксперимента осуществляли через 5 мес после окончания курса введения канцерогена путем декапитации. При аутопсии животных подопытной группы проводили ревизию органов брюшной полости с вскрытием толстой кишки. При патоморфологическом исследовании учитывали частоту развития новообразований, их морфологические особенности, локализацию. Животные, у которых не произошло формирования опухоли, в исследование не включены. При исследовании тимуса использовали следующие методы. Окраску гематоксилином - эозином. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре Leica ASP 200 (Leica, Германия) и заливали в парафин. Парафиновые срезы материала толщиной 3 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла (Mentzel Glasses super frost, Германия) и окрашивали гематоксилином-эозином по стандартной методике. Иммуногистохимический метод [3]. Исследования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные полилизином, высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Проводили иммуногистохимические реакции ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров Autostainer-360 (Thermo, Великобритания) и Leica Bond-Max (Leica, Германия) с применением систем визуализации En-vision (DAKO, Дания) и NovoLink polymer (NovoCastra, Великобритания). Для иммуногистохимического исследования использовали моно-и поликлональные антитела (МКАТ и ПКАТ) (Santa Cruze, США и NovoCastra, Великобритания): 1) МКАТ к панцитокератину для неселективной идентификации эпителиальных клеток тимуса; 2) МКАТ к CD3 для идентификации зрелых тимоцитов; 3) МКАТ к CD30 для идентификации активированных Т-лимфоцитов коркового вещества; 4) ПКАТ к белку S-100 для идентификации клеток нейроэктодермального генеза и дендритных клеток; 5) ПКАТ к синаптофизину для идентификации клеток нейроэндокринного происхождения; 6) МКАТ к CD68 для идентификации макрофагов долек тимуса; 7) ПКАТ к белку p53 для идентификации апоптотически измененных клеток в структурах дольки тимуса; 8) ПКАТ к белку bcl-2 для определения направленности апоптотических реакций в структурах дольки тимуса; 9) МКАТ к IgM и IgG для идентификации В-лимфоцитов и плазматических клеток в структурах нетимопоэтического микроокружения; 10) МКАТ к маркеру клеточной пролиферации Ki-67 для идентификации клеток, находящихся в митотической, G1-, S-и G2-фазах клеточного цикла. Компьютерную морфометрию. Цифровые снимки микропрепаратов получены с применением системы архивирования на базе микроскопа Leica DM4000B (Leica, Германия) с использованием цветной фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application Suite 3.6.0 (Leica, Германия). Микрофотографии для проведения морфометрических измерений были получены при увеличениях 50, 100 и 400 с обозначением градуировочной линейки на каждом снимке. Линейные морфометрические измерения площади мозгового вещества и толщины коркового вещества долек, а также площади долек выполнены с использованием лицензионной программы Leica Application Suite 3.6.0. Измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением лицензионной программы Микро-Анализ (ТелеМедТехника, Россия), а также демо-версии программы Sigma Scan Pro (Systat Software Inc, Япония). Интенсивность мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценивали методом автоматического выделения и подсчета площади интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка. Затем определяли долю площади структур, обладающих позитивной иммуногистохимической реакцией, по отношению к общей площади фотографии. Для каждого среза измерения выполнены не менее чем в 10 репрезентативных полях зрения при увеличении 400. При малом количестве клеток, дающих цитоплазматическую или мембранную окраску, применен метод их визуального подсчета в 10 репрезентативных полях зрения при увеличении 400. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую величину и ее ошибку. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента. Результаты исследования. Через 5 мес после введения канцерогена в толстой кишке у крыс на фоне предопухолевых изменений в виде пролиферации крипт и клеточной дисплазии различной степени формируются 1-2 опухоли, имеющие строение высокодифференцированной аденокарциномы. Строение тимуса крыс на фоне развития опухоли значительно отличается от такового у интактных животных. Если в норме дольки тимуса имеют полигональную форму с хорошо различимой границей между корковым и мозговым веществом, то введение канцерогена сопровождается выраженными инволютивными изменениями. Это проявляется уменьшением размеров и формированием «многолопастных» долек тимуса. Местами граница между дольками теряется, и формируется картина «сливающихся» долек с общим корковым веществом, при этом в центре органа располагаются крупные дольки с хорошо различимой границей коркового и мозгового вещества, а на периферии - более мелкие, с плохо различимой границей зон. В периферических отделах тимуса также встречаются атрофированные дольки, изолированные от основной массы жировой тканью. Изолированные периферические дольки - небольшого размера, в них практически неразличима граница коркового и мозгового вещества. Клеточный состав атрофичных периферических долек существенно отличается от долек, расположенных центрально. Сохраненные тимоциты присутствуют лишь по краю дольки в виде ободка, а основную массу клеток составляют плазматические клетки, макрофаги, а также эпителиальные клетки и эозинофильные гранулоциты. Макрофаги этих долек содержат в цитоплазме зерна коричневого пигмента, напоминающего гемосидерин, а также фрагменты ядер фагоцитированных лимфоцитов (рисунок, а). В дольках регистрируется значимое уменьшение их площади на 29% при одновременном снижении относительной массы тимуса на 22%. При канцерогенезе отмечается существенное уменьшение как площади мозгового вещества (на 37%), так и толщины коркового (на 16%). Кроме того, при иммуногистохимическом исследовании выявлено значительное увеличение числа СD3+тимоцитов в корковом веществе в 1,65 раза и мозговом веществе - на 14% (см. рисунок, б). Значительно изменяются количество и цитоархитектоника эпителиальных клеток тимуса, выявляемых иммуногистохимической реакцией с панцитокератином: происходит увеличение их количества в корковом веществе более чем в 2 раза, а в мозговом - в 1,86 раза (таблица). Отростки кортикальных эпителиоцитов анастомозируют между собой и формируют густую сеть, в ячейках которой располагаются лимфоциты. Медуллярные эпителиоциты, напротив, формируют компактные скопления из большого числа клеток, которые лежат периваскулярно в центральных отделах мозговой зоны, но с кортикальными эпителиоцитами не контактируют (см. рисунок, в). При иммуногистохимическом исследовании тимуса после введения канцерогена отмечалось значимое повышение содержания активированных CD30+-лимфоцитов коркового вещества (см. рисунок, г), CD68+-макрофагов, S-100+-клеток нейроэктодермального гистогенеза и дендритных клеток, а также синаптофизин+-клеток нейроэндокринного происхождения (см. таблицу). Иммуногистохимическое исследование мозгового вещества атрофированных периферических долек демонстрирует существенное отличие клеточного состава от такового у интактных крыс. Основная масса клеток представлена зрелыми плазматическими клетками, дающими интенсивную реакцию с МКАТ к IgМи IgG, число которых составляет 44 и 55% в поле зрения соответственно (см. рисунок, д). Кроме мозгового вещества долек, расположенных на периферии, значительное число IgM-и IgG-позитивных клеток присутствуют в междольковых септах центральной части органа. В сохраненных дольках количество IgM-и IgG-позитивных клеток значимо выше, чем у интактных крыс, почти в 5 раз. При определении белков-регуляторов апоптоза в структурах дольки тимуса животных, получавших канцероген, установлено повышение экспрессии bcl-2 более чем в 8 раз (см. рисунок, е), а также снижение белка р53 более чем на 25% в тимоцитах как коркового, так и мозгового вещества. Использование МКАТ к белку Ki-67 позволило установить повышение его экспрессии в тимоцитах коркового и мозгового вещества на 24 и 41% соответственно. Обсуждение полученных данных. В ходе настоящего исследования установлено, что введение канцерогена приводит к увеличению в тимусе числа клеток, экспрессирующих bcl-2, S-100 и синаптофизин. Как известно, антиапоптотический белок bcl-2 локализуется в иммунных клетках памяти, и повышение его экспрессии служит маркером высокой интенсивности клеточного деления при иммунных нарушениях [14]. Белок р53 также является регулятором апоптоза и осуществляет надзор за состоянием ДНК. Экспрессия этого белка в клетке может указывать на высокую интенсивность апоптоза, а при опухолевой трансформации - на наличие мутации этого гена. При активации в цитоплазме клетки bcl-2 последний вступает в комплекс с белком р53 и инактивирует его, тем самым блокирует апоптоз [11]. Кроме того, изменения в экспрессии белков-регуляторов апоптоза в совокупности с увеличением числа дендритных клеток и клеток АРUD-серии свидетельствуют о реакции тимуса на развитие опухоли еще на стадии предопухолевых изменений. Повышение экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67, которое совпадает с увеличением числа активных Т-лимфоцитов и клеток тимопоэтического микроокружения, может свидетельствовать о повышении тимоцитопоэза. Эти изменения обусловлены как ответом иммунной системы на рост опухоли, так и, возможно, гиперпродукцией Т-хелперов II типа, необходимых для формирования опухолевой иммунной толерантности [1, 13]. Развитие злокачественной опухоли толстой кишки сочетается с изменением соотношения между CD3+-тимоцитами мозгового и коркового вещества с преобладанием последних. Уменьшение количества зрелых мозговых CD3+-тимоцитов можно объяснить их усиленным выходом на периферию в связи с опухолевым ростом, а также увеличением количества клеток окружения вследствие инволютивных изменений тимуса. Повышение количества кортикальных СD3+-клеток может указывать как на усиление дифференцировки тимоцитов, так и на уменьшение числа незрелых CD3--форм вследствие недостаточного поступления из костного мозга. Большое значение в способности тимуса к выработке лимфоцитов принадлежит эпителиальной сети коркового вещества. Известно, что эпителиальные клетки вырабатывают тимические гормоны, в том числе тимулин и тимопоэтин, которые необходимы для реаранжировки клеточных рецепторов в процессе дифференцировки тимоцитов [15]. Нами установлено, что инволютивные изменения при введении канцерогена приводят к изменению цитоархитектоники сети кортикальных эпителиоцитов и сопровождаются значимым увеличением их числа. Возможно, сохранение сети эпителиальных клеток является обязательным условием для поддержания тимоцитопоэза при инволюции [8]. Таким образом, мы полагаем, что развивающаяся опухоль через 5 мес способна оказывать кратковременное стимулирующее влияние на продукцию Т-хелперов, которое сочетается с ее токсическим влиянием на костный мозг и нарушением поступления предшественников тимопоэза в тимус. Развивающаяся опухоль, по-видимому, с одной стороны, угнетает поступление предшественников тимопоэза в железу, с другой - усиливает пролиферацию и дифференцировку тимоцитов в зрелые формы.

About the authors

G. Yu. Struchko

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Email: glebstr@mail.ru

L. M. Merkulova

I. N. Ulyanov Chuvash State University

Ye. V. Moskvichyov

I. N. Ulyanov Chuvash State University

References

Supplementary files