STUDY OF CHONDROCYTE PROLIFERATIVE ACTIVITY IN THE CANINE ARTICULAR CARTILAGE DURING LENGTHENING OF THE ADJACENT LIMB SEGMENT

Full Text

Хондроциты составляют незначительную часть объёма суставного гиалинового хряща, но они играют важную роль, так как обеспечивают поддержание состояния внеклеточного матрикса в процессах нормальной жизнедеятельности и развития дегенеративных заболеваний. Увеличение числа активно пролиферирующих и продуцирующих клеток - основной источник восстановительных процессов в суставном хряще [4]. В исследованиях на животных установлено, что с возрастом в результате апоптоза происходит значительное снижение численной плотности хондроцитов, что интерпретируется авторами как начало остеоартроза [10]. Митотически делящиеся хондроциты обнаруживались до 8 нед постнатального онтогенеза у крыс, при экспериментально индуцированном остеоартрозе митотический индекс приближался к нулю, при этом снижалась и численность хондроцитов [11]. Фигуры митоза хондроцитов и ассоциированный с пролиферацией антиген Ki-67 не выявлялись в нормальном хряще коленного сустава у взрослых людей, однако Ki-67 обнаружен в некоторых образцах суставного хряща у больных с остеоартрозом преимущественно в поверхностной и промежуточных зонах [9]. В прицельном биомеханическом исследовании, проведенном на кроликах, доказано, что в результате натяжения мягких тканей при ортопедическом удлинении голени отчетливо выражена компрессия суставных поверхностей коленного сустава [14]. В модели ex vivo обнаружено моделирующее воздействие механической компрессии на пролиферацию хондроцитов [13]. Сведения о пролиферативных возможностях клеток суставного хряща при ортопедическом удлинении конечности в литературе отсутствуют. Цель настоящей работы - изучение пролиферативной активности хондроцитов в суставном хряще коленного сустава у собак при удлинении голени. Материал и методы. Изучен суставной хрящ наружного мыщелка бедра у 15 подопытных и 5 интактных (контроль) беспородных собак I категории (длина голени 18-21 см) в возрасте 1,5-2 лет и массой 18-25 кг. Содержание и оперативные вмешательства проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказы № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г., № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06. 2003 г.) и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986) [3]. Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова. Всем подопытным животным после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей методом чрескостного дистракционного остеосинтеза осуществляли дозированное удлинение правой голени на 28 мм по 1 мм за 4 приема (эксперимент выполнен канд. вет. наук С. А. Емановым). Через 28 сут дистракции, 30 сут фиксации и через 30 сут после снятия аппарата после эвтаназии животных передозировкой барбитуратов вскрывали коленный сустав и с передней поверхности наружного мыщелка бедренной кости вырезали кусочки суставного хряща размером 2-3×5-6 мм. Часть материала для изготовления парафиновых срезов обрабатывали по стандартной методике [5]. На срезах, помещенных на стекла с поли-л-лизином, с использованием набора реактивов для иммуногистохимии и системы визуализации RE7140-К, моноклональных антител к Ki-67 (готовые к применению) фирмы «Novocastra» (Великобритания) определяли экспрессию белка Ki-67 согласно протоколу фирмы производителя. Ki-67 - ядерный антиген, экспрессируемый в пролиферативной фазе клеточного цикла (фазы G1, S, G2, M) и отсутствующий в фазе G0. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная для Ki-67. Индекс Ki-67 (InKi-67) вычисляли как отношение клеток, экспрессирующих этот антиген, к общему количеству подсчитанных клеток, выраженное в процентах. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ у интактных животных. Часть материала после альдегидно-осмиевой фиксации обрабатывали по разработанной нами методике [7] и заключали в аралдит. На ультратоме Nova (LKB, Швеция) изготавливали эпоксидные полутонкие (толщиной 0,5-1,0 мкм) срезы увеличенной площади [6], которые окрашивали метиленовым синим - основным фуксином. Определяли относительные средние значения (в процентах от значений у интактных животных) площади сечения хондроцитов (Sch) и их численной плотности (NAch) в поверхностной, промежуточной и глубокой зонах хряща. Все препараты исследовали, используя фотомикроскоп (Оpton, Германия). Гистоморфометрические исследования выполнены с помощью аппаратно-программного комплекса «ДиаМорф» (Москва) и программы ВТ-Мастер-Морфология (ВидеоТест, Россия). Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения и объема выборок значимость различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона и программы AtteStat (тесты запрограммированы И. П. Гайдышевым [1] и помещены в динамически подключаемую библиотеку программы Microsoft Excel 97). Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. При светооптическом исследовании полутонких срезов суставного хряща у интактных собак деструктивные изменения хондроцитов не выявлены. Изредка они обнаруживались в хондроцитах двучленных изогенных групп, преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны хряща. В подопытной группе через 28 сут дистракции в поверхностной зоне суставного хряща были отмечены деструктивные изменения: морфологические признаки некроза и апоптоза отдельных хондроцитов, нарушение гомогенности межклеточного вещества - очаги демаскирования коллагеновых волокон. Под такими участками в промежуточной зоне была увеличена частота встречаемости двучленных изогенных групп клеток (рис. 1, а). В части наблюдений отмечено нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ. Обнаруженные изменения хрящевой ткани имели мозаичное расположение, участки с демаскированными коллагеновыми волокнами в суставном хряще чередовались с неповрежденными, имеющими обычную структуру. Через 30 сут фиксации уменьшились частота встречаемости и объем участков с демаскированными волокнами. В поверхностной зоне были выявлены многочленные изогенные группы, состоящие из 8 клеток и более (см. рис. 1, б). Через 1 мес после снятия аппарата сохранялось нарушение организации матрикса хряща поверхностной зоны. Наибольшая частота встречаемости изогенных групп отмечена в промежуточной зоне хряща, где преобладали в основном двучленные изогенные группы клеток (см. рис. 1, в), единичные четырехчленные изогенные группы клеток были отмечены в глубокой зоне. На всех этапах эксперимента фактор пролиферации - белок Ki-67 был выявлен в виде окрашенного в коричневый цвет ядерного субстрата хрящевых клеток преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах хряща (рис. 2). В суставном хряще у всех экспериментальных животных InKi-67 превышал таковой в контроле, его максимальные значения были зарегистрированы в конце периода дистракции (таблица). К концу дистракции было выявлено значимое снижение численной плотности хрящевых клеток в поверхностной и глубокой зонах хряща (рис. 3, а). Наиболее выраженное уменьшение площади сечения клеток было зарегистрировано в промежуточной зоне (см. рис. 3, б). Здесь же отмечена и преимущественная локализация маркера пролиферации. К концу периода фиксации по сравнению с предыдущим этапом эксперимента выявлено увеличение численной плотности клеток во всех зонах хряща, но особенно в поверхностной и промежуточной зонах и резкое снижение площади сечения хондроцитов в поверхностной зоне. При этом сохранялись высокие значения InKi-67. В поверхностной зоне хряща выявлены многочисленные Ki-67позитивные хондроциты в составе многочленных изогенных групп. Через 1 мес после снятия аппарата численная плотность хондроцитов в поверхностной и промежуточной зонах увеличивалась, при этом хондроциты были уменьшены в размерах. По сравнению с контролем сохранялись высокие значения InKi-67. В глубокой зоне численная плотность клеток резко снизилась, но увеличилась средняя площадь сечения хондроцитов по сравнению с таковыми на предыдущих этапах эксперимента. Обсуждение полученных данных. При удлинении смежного сегмента конечности деструктивные изменения выявлены преимущественно в поверхностной и глубокой зонах суставного хряща. Демаскирование коллагеновых волокон в поверхностной зоне хряща отражает реакцию на избыточную статическую нагрузку, а проникновение сосудов в глубокую зону со стороны субхондральной кости - на нарушение кровоснабжения. К концу эксперимента в глубокой зоне хряща сохранялась сниженная численная плотность хондроцитов. Поскольку хондроциты - единственный тип клеток, формирующих хрящ, то восстановление их численной плотности должно определяться их пролиферацией. Возбуждение пролиферативных возможностей хондроцитов в нашем эксперименте подтверждается морфологически - обнаружением изогенных групп. Несмотря на то, что в эксперименте отмечены тесные клеточные пары, фигуры митозов хондроцитов обнаружить не удалось. M. A.Gómez-Camarillo и J. B. Kouri [11] цитируют многих авторов, которые с помощью различных методов доказали наличие пролиферации хондроцитов в суставном хряще у половозрелых особей при остеоартрозе, однако прямых подтверждений пролиферации - признаков митоза - авторам выявить не удалось. Выявленные в нашем исследовании морфологические признаки некроза и апоптоза хондроцитов соответствовали известным из литературы [2, 12] и свидетельствовали об убыли их популяции. Анализ динамики площади, численной плотности хондроцитов, а также анализ топографии изогенных групп и маркера пролиферативной активности Ki-67 свидетельствовали о том, что в данных условиях эксперимента восстановление популяции хондроцитов происходит за счет пролиферации хрящевых клеток, преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. По данным Е. В. Четиной [8], локализация маркеров пролиферативной активности Ki-67 и PCNA в эксплантатах суставного хряща у взрослого быка определялась в средней зоне. При культивировании с пептидом СВ12-2, разрушающим коллаген на 1-е сутки, окрашивание пролиферативных антигенов отмечено в средней и глубокой зонах, на 4-е сутки окрашивание пролиферативных антигенов оставалось интенсивным и включало большее число клеток также и в поверхностной зоне. При моделировании остеоартроза у крыс T. Aigner и соавт. [9] обнаружили маркер пролиферации Ki-67 в поверхностной и промежуточных зонах. M. A.Gómez-Camarillo и J. B. Kouri в суставном хряще у крыс при экспериментально индуцированном остеоартрозе фигуры митоза не обнаружили, но отмечали двуядерные хондроциты и пары тесно расположенных клеток. При этом ряд исследователей [9-11] выявили снижение численной плотности клеток. Aigner и соавт. [9] повышение пролиферативной активности хондроцитов в верхних зонах хряща при остеоартрозе связывают с разрушением коллагена. Аналогичные результаты при культивировании эксплантатов суставного хряща у взрослого быка в присутствии пептида, разрушающего коллаген, получены Е. В. Четиной [8]. В нашем исследовании повышение пролиферативной активности хондроцитов в поверхностной зоне, вероятно, можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на нарушение структуры межклеточного вещества - хряща суставной поверхности. К концу эксперимента уменьшались частота встречаемости и объем участков с демаскированными коллагеновыми волокнами, численная плотность хондроцитов в поверхностной и промежуточной зонах превышала таковую в норме, деструктивные изменения не прогрессировали. Таким образом, при удлинении голени в суставном хряще мыщелков бедра отмечено повышение пролиферативной активности хондроцитов с преимущественной концентрацией маркера Ki-67 в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах. При этом, по окончании удлинения наблюдалось стойкое увеличение численности хондроцитов по сравнению с таковой в интактной группе в поверхностной и промежуточной, но не в глубокой зонах хряща.

About the authors

T. A. Stupina

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: StupinaSTА@mail.ru
Laboratory of Morphology

M. M. Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: m.m.sch@mail.ru
Clinico-Experimental Labora tory for Reconstructive and Restorative Microsurgery and Surgery of the Hand

N. A. Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: nshchudlo@mail.ru
Clinico-Experimental Labora tory for Reconstructive and Restorative Microsurgery and Surgery of the Hand

References

Supplementary files