INTERSTITIAL CELLS OF CAJAL IN THE SMOOTH MUSCLE TISSUE OF THE GALLBLADDER AND BILE DUCTS

Full Text

В настоящее время в литературе появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что в регуляции функциональной деятельности гладкой мышечной ткани органов пищеварительного тракта [1, 9], репродуктивной [10], дыхательной [3] и мочевыделительной систем [4] важная роль принадлежит интерстициальным клеткам Кахаля (ИКК). До настоящего времени цитологические признаки и специфика их функциональной деятельности остаются предметом дискуссии. Показано, что периодичность сократительной активности гладкой мышечной ткани в органах обеспечивается наличием специфических водителей ритма, которые могут располагаться в ней диффузно [12] или формировать специальные зоны пейсмекерной активности [7]. Данный тип клеток описан в составе мышечной ткани желчного пузыря [8], тем не менее, вопрос об их структурной организации, распределении в различных отделах желчевыводящих путей остается открытым. Актуальность данного вопроса обусловлена также тем, что их дискинезия связана с нарушением функциональной деятельности гладкой мышечной ткани, входящей в состав их стенки. Цель настоящей работы - сравнительный анализ клеточных элементов гладкой мышечной ткани желчного пузыря и желчевыводящих путей. Материал и методы. Исследование выполнено на 15 лабораторных морских свинках-самцах массой 600-900 г в возрасте 6-7 мес с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Изучены фрагменты стенки желчного пузыря и желчных протоков. ИКК идентифицировали, применяя иммуноцитохимическую реакцию выявления маркера с-kit-рецепторной тирозинкиназы (CD117) [11]. Для оценки экспрессии c-kit материал фиксировали в 4% растворе параформальдегида на 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, Sigma, США) при pH 7,4 и заливали в парафин, затем готовили срезы толщиной 5-7 мкм, которые депарафинировали, инкубировали в РВS с добавлением 0,6% перекиси водорода, 1% раствора Тритона Х-100 и 5% козьей сыворотки (VectorLaboratories, Inc, США). Использовали поликлональные кроличьи антитела к белку c-kit (СD-117) (SantaCruz Biotechnology) в разведении 1:100 (экспозиция в течение 2 ч при комнатной температуре). Визуализацию реакции проводили с помощью вторичных моноклональных кроличьих антител, конъюгированных с люминесцентным флюорохромом в разведении 1:100 (Alexa Fluor 568 красный, IgG, Molecular Probes, Inc) в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре. Ядра клеток докрашивали ядерным красителем DAPI (4,6-диамидино2-фенилиндол, Molecular Probes, Inc.). Контроль реакции осуществляли на срезах без специфических первичных антител. Результаты окрашивания оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа Olympus ВХ43 (Olympus, Япония). Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 2 ч с последующей фиксацией в течение 1 чв 2% растворе четырехокиси осмия при температуре 5 ºС. Кусочки промывали в буфере, затем проводили обезвоживание в ацетоне возрастающей концентрации (50, 70, 90, 100%), контрастировали в 70º спирте и 1% уранилацетате в течение 12 ч и заливали в смесь эпона-аралдита. Для обеспечения прицельного электронномикроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали, и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (Bromma, Швеция), подвергали двойному контрастированию в 2,5% растворе уранилацетата и 0,3% растворе цитрата свинца по Рейнолдсу, росматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-100 СХ (JEOL, Япония). Результаты исследования. В различных отделах желчного пузыря, в стенке пузырного и общего желчного протока (рис. 1, а, б) были выявлены клетки, дающие позитивную реакцию на c-kit-рецепторную тирозинкиназу. В теле и шейке желчного пузыря (см. рис. 1, а) они локализуются в мышечной оболочке, а также в слизистой оболочке, где характеризуются более диффузным расположением. В стенке общего желчного протока сравнительно небольшое количество c-kit-позитивных клеток обнаружено вблизи циркулярно ориентированных пучков гладких миоцитов. Единичные клетки расположены в субэпителиальной области. ИКК, интегрированных в сетчатую структуру, нам не удалось обнаружить ввиду того, что срезы протоков были сделаны в поперечной плоскости, но возможность наличия продольно ориентированной сети ИКК по ходу протоков исключить нельзя. Плотность расположения c-kitпозитивных клеток в стенке различных отделов желчного пузыря была выше, чем в составе желчных протоков. Электронно-микроскопический анализ показал, что ИКК в стенке желчного пузыря и желчных протоков имеют вытянутую форму и характеризуются значительным количеством цитоплазматических отростков различной протяженности, которые формируют тесные мембранные контакты с близлежащими гладкими миоцитами (рис. 2, 3). В области контактов в цитоплазме отростков наблюдается скопление митохондрий. Ядра располагается в центре, имеют вытянутую форму, содержат умеренное количество гетерохроматина, который в основном локализован под ядерной оболочкой. Органеллы распределены равномерно, комплекс Гольджи развит умеренно, при этом доминирует хорошо развитая агранулярная эндоплазматическая сеть, в периферических зонах располагаются значительное количество вакуолей, лизосомы и отдельные свободные рибосомы. Базальная мембрана у ИКК имеет различную степень развития, кавеолы аналогичны таковым в гладких миоцитах. В ИКК не удалось выявить плотные полоски и плотные тельца. В цитоплазме отсутствуют элементы организованного сократительного аппарата. Тонкие филаменты (5 нм) встречаются крайне редко и располагаются на периферии цитоплазмы. Отмечаются единичные микровыросты плазмолеммы. Другой характерной особенностью ИКК является наличие в цитоплазме крупных вакуолей. Они могут иметь гомогенную структуру или содержать материал различной электронной плотности. Обсуждение полученных данных. В последние годы понимание механизмов функционирования гладкой мышечной ткани висцеральных органов значительно расширилось благодаря исследованию ИКК. Полученные данные свидетельствуют о том, что эти клетки являютcя источником генерации медленных волн [7] и ответственны за спонтанное ритмическое сокращение мышечной ткани пищеварительного тракта [9]. По мнению ряда авторов, спонтанные ритмические сокращения мышечной ткани желчных протоков также обусловлены функциональной активностью ИКК [5]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что c-kit-позитивные клетки являются постоянным компонентом стенки различных отделов желчевыводящих путей. При этом они не только инкорпорированы в состав мышечной ткани желчного пузыря и желчных протоков, но локализуются и в субэпителиальной зоне слизистой оболочки. Сведения о вероятной локализации и концентрации c-kit-позитивных клеток в желчном пузыре и различных отделах желчевыводящих путей противоречивы. Ряд авторов отмечают увеличение концентрации ИКК в стенке дистального отдела общего желчного протока [5]. Однако нам не удалось выявить существенных отличий в распределении ИКК в различных отделах желчных протоков. Ультраструктурный анализ, проведенный в нашей работе, позволяет говорить о наличии в мышечной ткани желчевыводящих путей клеток, имеющих характеристики ИКК [12] и формирующих тесные мембранные контакты с гладкими миоцитами. Вопрос об их точной цитологической идентификации является открытым. До настоящего времени не существует единой точки зрения о типах ИКК и их структурно-функциональных характеристиках. Рядом авторов, на основании ультраструктурных параметров, описаны от 3 [2, 11] до 5 [12] типов ИКК, при этом показано, что ультраструктура ИКК аналогичного типа может варьировать в зависимости от биологического вида изучаемого объекта. Данная классификация не является общепризнанной, но используется для анализа ИКК в составе различных органов. Интерпретация полученных данных представляется сложной в связи с тем, что предполагается возможность существования органных особенностей субпопуляций ИКК, обусловленных спецификой функциональной деятельности различных систем [6]. Дальнейший анализ детальных характеристик ИКК в желчном пузыре и желчных протоках у млекопитающих позволит раскрыть морфофункциональные механизмы дисфункций желчевыводящих путей.

About the authors

A. L. Zashikhin

Northern State Medical University

Email: zashihin2@atknet.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

A. Yu. Liubeznova

Northern State Medical University

Department of Histology, Cytology and Embryology

Yu. V. Agafonov

Northern State Medical University

Email: profALZ@yandex.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

References

Supplementary files