EXPRESSION OF SEROTONIN TRANSPORTER IN THE VENTROLATERAL PART OF THE NUCLEUS OF THE SOLITARY TRACT IN RATS IN THE EARLY POSTNATAL PERIOD IN NORM AND FOLLOWING SEROTONERGIC SYSTEM DEFICIENCY IN THE PRENATAL PERIOD OF DEVELOPMENT

Full Text

Серотониновый транспортный трансмембранный белок (5-НТТ) является основным регулятором содержания внеклеточного серотонина, осуществляющим его обратный захват из межклеточного пространства и, таким образом, определяющим степень его трансмиссии. Показано, что 5-НТТ экспрессируется, главным образом, серотонинергическими нейронами [12, 14], при этом в нейропиле местами локализации 5-НТТ являются варикозные расширения терминальных отростков, где нейротрансмиттер может синтезироваться, сохраняться и высвобождаться [5, 15, 16], а также крупные и мелкие зерна, выявляющиеся при помощи иммуноцитохимической реакции на 5-НТТ, которые могут представлять собой пресинаптические места связывания 5-НТТ [1, 13, 14]. В поздние сроки пренатального периода развития и первые недели постнатального периода у мышевидных грызунов в некоторых формациях головного мозга (в ядрах таламуса, тригеминальном и кохлеарном ядрах, гиппокампе и неокортексе) были выявлены отдельные нейроны, экспрессирующие 5-НТТ, но не относящиеся к серотонинергической системе [6, 8, 12]. Полагают, что в таких случаях имеет место «транзиторная», или кратковременная, экспрессия 5-НТТ несеротониновыми нейронами [6, 12]. Ядро солитарного тракта обладает отчетливо выраженной висцеротопией, в него поступают многочисленные афферентные волокна от висцеральных систем, а также оно имеет зоны, проецирующиеся на различные внутренние органы [10, 11], в том числе, на обеспечивающие жизненно важные сердечнососудистые и дыхательные рефлексы [9, 10]. Вентролатеральная часть ядра солитарного тракта входит в состав дорсальной группы респираторных ядер, состоящих, преимущественно, из инспираторных бульбоспинальных нейронов, проецирующихся на спинальные диафрагмальные и межреберные инспираторные мотонейроны, осуществляющие процесс вдоха [7, 10]. Известно, что серотонин принимает непосредственное участие в регуляции респираторной функции [6], однако экспрессия 5-НТТ, как основного фактора, регулирующего его трансмиссию в области продолговатого мозга, а также зависимость экспрессии от содержания самого серотонина, практически не изучены. В связи с этим целью данной работы явилось исследование экспрессии серотонинового транспортера в вентролатеральной части ядра солитарного тракта в ранние сроки постнатального периода в норме и при дефиците серотонина в пренатальный период развития. Материал и методы. Работа выполнена на лабораторных крысах линии Вистар. Содержание животных и все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). В работе использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента синтеза серотонина) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс (n=5) вводили внутрибрюшинно на 16-е сутки беременности, при этом происходило снижение содержания эндогенного серотонина до 50-80% в период формирования у плодов собственной серотонинергической системы [1, 3]. Головной мозг у крысят исследовали на 5-еи 10-е сутки после рождения. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок (n=3). В каждый срок исследования было использовано по 5-6 как подопытных, так и контрольных крысят. Материал фиксировали в цинк-этанолформальдегиде на фосфатно-солевом буфере (pH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 4-5 мкм. Исследовали ростральную и каудальную области вентрального и латерального субъядер ядра солитарного тракта. Ростральную область вентрального и латерального субъядер исследовали на уровне nucl. facialis (Bregma - 11,64 мм), а каудальную область на уровне nucl. ambiquus (Bregma - 12,00-12,84 мм). Выявление 5-НТТ проводили с использованием первичных anti-Serotonin transporter antibody (AbСam, Великобритания) и вторичных реагентов из набора LSAB2 System-HRP (Dako, Дания). Для визуализации продукта реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Майера (Bio-Optica, Италия) или тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Условия проведения иммуноцитохимической реакции были стандартизированы, все процедуры при иммуноокрашивании гистологических срезов продолговатого мозга, полученных от интактных и подопытных животных в разные сроки развития, осуществляли одновременно. При анализе результатов реакции учитывали окрашивание цитоплазмы нейронов, наличие терминальных варикозных расширений и распределение иммунопозитивных гранул - как предполагаемых мест связывания 5-НТТ [12]. Морфологический анализ и подсчет нейронов проводили на цифровых изображениях серийных срезов разных областей изучаемых субъядер, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). Подсчитывали число иммунопозитивных нейронов на стандартной площади 0,1 мм². Статистическую обработку полученных показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0., ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Ростральная часть вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта. На 5-еи 10-е сутки у контрольных животных в ростральной части вентрального субъядра присутствует по 2,4±0,8 и 2,0±0,7 иммунопозитивных нейронов на стандартной площади среза соответственно. На 5-е сутки в нейропиле визуально определяется довольно высокая плотность сплетения отростков и мелких варикозных расширений (рисунок, а, б). К 10-м суткам происходит снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы нейронов, сокращение количества терминальных варикозных расширений и появление иммунопозитивных пылевидных зерен. На 5-еи 10-е сутки в ростральной части вентрального субъядра при пренатальной недостаточности серотонинергической системы динамика изменений соответствует таковой в контроле. В субъядре обнаруживается по 2,0±0,4 и 1,1±0,9 иммунопозитивных нейронов соответственно. К 10-м суткам, также как в контроле, происходит некоторое снижение интенсивности иммунной реакции цитоплазмы нейронов, сокращение количества терминальных варикозных расширений и появление иммунопозитивных пылевидных зерен. На 5-еи 10-е сутки у животных в контроле в ростральной части латерального субъядра присутствует незначительное число иммунопозитивных нейронов 1,3±0,5 и 1,0±0,7 соответственно. В нейропиле на 5-е сутки плотность сплетения отростков и расположения терминальных варикозных расширений выше, чем на 10-е сутки. При пренатальной недостаточности серотонинергической системы на 5-еи 10-е сутки в латеральном субъядре число иммунопозитивных нейронов составляет 0,8±0,3 и 0,60±0,10 соответственно. В нейропиле динамика изменений соответствует таковой в контроле. Таким образом, у животных в контроле в ростральной области вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, очень мало, их численность на протяжении исследованного периода развития не изменяется. У подопытных крыс, также как в контроле, интенсивность экспрессии 5-НТТ незначительная, и численность иммунопозитивных нейронов соответствует контрольным значениям. Каудальная часть вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта. На 5-е сутки у животных в контроле в каудальной части вентрального субъядра присутствует 8,3±1,4 иммунопозитивных нейронов. В нейропиле обнаруживается плотное сплетение иммунопозитивных тонких терминальных отростков, имеющих множество варикозных расширений и гранул на их поверхности (см. рисунок, в, г). К 10-м суткам (см. рисунок, д, е) число иммунопозитивных нейронов значимо снижается до 5,1±1,5, однако, в нейропиле плотность сети отростков примерно соответствует таковой на 5-е сутки. На 5-е сутки у подопытных животных в каудальной части вентрального субъядра присутствует 4,7±1,4 иммунопозитивных нейронов (на центральных срезах). В нейропиле выявляется довольно плотное сплетение отростков с множеством варикозных расширений и гранул. На 10-е сутки число иммунопозитивных нейронов соответствует таковому на 5-е сутки и составляет 4,5±0,8. В нейропиле морфологическая картина схожа с таковой на 5-е сутки. На 5-е сутки у животных в контроле в каудальной части латерального субъядра на стандартной площади среза присутствует 3,1±1,1 иммунопозитивных нейронов. В нейропиле обнаруживается плотное сплетение терминальных отростков и множество варикозных расширений и гранул. К 10-м суткам число иммунопозитивных нейронов соответствует таковому на 5-е сутки и составляет 2,8±0,9, но в нейропиле плотность сплетения отростков и варикозных расширений снижается. На 5-еи 10-е сутки у подопытных крыс в каудальной части латерального субъядра значимо сокращается число иммунопозитивных нейронов до 1,3±0,6 и 1,0±0,7 соответственно. В нейропиле плотность сплетения отростков и варикозных расширений также снижается по сравнению с контролем. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в ранний постнатальный период в ростральной и каудальной частях вентролатерального отдела ядрá солитарного тракта наблюдается разная динамика экспрессии 5-НТТ. У контрольных и подопытных животных в ростральной части вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта число нейронов, синтезирующих 5-НТТ, невелико и с возрастом не изменяется. Вероятно, уровень экспрессии 5-НТТ здесь низкий, и пренатальный дефицит серотонина не оказывает заметного влияния. В каудальной части вентрального субъядра на 5-е сутки после рождения у контрольных животных имеется довольно большое число нейронов, синтезирующих 5-НТТ, что свидетельствует об интенсивной его экспрессии, однако с возрастом (на 10-е сутки) количество таких нейронов резко снижается (почти в 2 раза). Результаты исследования показали, что в ранний постнатальный период в этой области субъядрá при пренатальном дефиците серотонина численность нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, сокращается примерно в 2 раза, она сохраняется таковой до 10-х суток. Вероятно, эти изменения имеют вторичный характер и являются результатом либо нарушения синтетических процессов, вследствие задержки дифференцировки нейронов, либо сокращения афферентных и эфферентных связей в результате недоразвития мишеней. В каудальной части латерального субъядра у контрольных животных на 5-е сутки после рождения число нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, небольшое, но немного, однако, значимо снижающееся к 10-м суткам; у подопытных крыс такие нейроны единичны и с возрастом их количество не изменяется. В каудальной части как вентрального, так и латерального субъядер количество нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, почти в 3-3,5 раза больше и, вероятно, уровень экспрессии 5-НТТ здесь значительно выше, чем в ростральной. Представленные наблюдения, по-видимому, могут отражать разную функциональную активность нейронов ростральных и каудальных частей субъядер, однако, следует принимать во внимание особенности строения и организации межнейронных связей в этой области продолговатого мозга. Установлено, что вентролатеральный отдел ядрá солитарного тракта отличается разнообразием поступающих сюда висцеральных афферентных проекций и нисходящих проекций из вышележащих отделов головного мозга. Важная информация для регуляции дыхания поступает в каудальные области респираторных субъядер ядра солитарного тракта как по афферентным волокнам от различных структур, участвующих в процессе дыхания, так и блуждающего нерва [11]. Более того, были установлены обширные эфферентные связи нейронов каудальной части вентролатеральной области с амбигуальным и ретроамбигуальным ядрами (иннервирующими мускулатуру бронхов, сердца, легких, участвующих в регуляции фаз дыхательного цикла), входящими в состав вентральной респираторной группы ядер, а также и с ядрами спинного мозга [2, 9]. В ростральной части, напротив, выявлено небольшое число нейронов, дающих проекции на межреберные респираторные мышцы [4]. Таким образом, результаты исследования показали, что в ранние сроки постнатального развития в вентролатеральной части ядрá солитарного тракта имеет место временная экспрессия серотонинового транспортера, наиболее выраженная в каудальной части вентрального субъядра. Присутствие транспортера предполагает трансмиссию серотонина, который, учитывая множественные афферентные и эфферентные связи с нейронами ядер вентральной респираторной группы и ядрами спинного мозга, может участвовать в регуляции механизмов фаз респираторного цикла. Нарушение экспрессии серотонинового транспортера в вентральном и латеральном субъядрах в ранний постнатальный период, вероятно, может вызывать снижение уровня трансмиссии серотонина, контролирующего деятельность инспираторных нейронов этих субъядер, что, в свою очередь, может быть причиной респираторных нарушений у новорожденных и приводить к апноэ и синдрому внезапной детской смерти.

About the authors

L. I. Khozhai

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology, St. Petersburg

Email: astarta0505@mail.ru
Laboratory of Ontogenesis of the Nervous System

References

Supplementary files