ЭКСПРЕССИЯ СЕРОТОНИНОВОГО ТРАНСПОРТЕРА В ВЕНТРОЛАТЕРАЛЬНОЙ ЧАСТИ ЯДРА СОЛИТАРНОГО ТРАКТА У КРЫС В РАННИЕ СРОКИ ПОСТНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА В НОРМЕ И ПРИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В ПРЕНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД РАЗВИТИЯ

Полный текст

Серотониновый транспортный трансмембранный белок (5-НТТ) является основным регулятором содержания внеклеточного серотонина, осуществляющим его обратный захват из межклеточного пространства и, таким образом, определяющим степень его трансмиссии. Показано, что 5-НТТ экспрессируется, главным образом, серотонинергическими нейронами [12, 14], при этом в нейропиле местами локализации 5-НТТ являются варикозные расширения терминальных отростков, где нейротрансмиттер может синтезироваться, сохраняться и высвобождаться [5, 15, 16], а также крупные и мелкие зерна, выявляющиеся при помощи иммуноцитохимической реакции на 5-НТТ, которые могут представлять собой пресинаптические места связывания 5-НТТ [1, 13, 14]. В поздние сроки пренатального периода развития и первые недели постнатального периода у мышевидных грызунов в некоторых формациях головного мозга (в ядрах таламуса, тригеминальном и кохлеарном ядрах, гиппокампе и неокортексе) были выявлены отдельные нейроны, экспрессирующие 5-НТТ, но не относящиеся к серотонинергической системе [6, 8, 12]. Полагают, что в таких случаях имеет место «транзиторная», или кратковременная, экспрессия 5-НТТ несеротониновыми нейронами [6, 12]. Ядро солитарного тракта обладает отчетливо выраженной висцеротопией, в него поступают многочисленные афферентные волокна от висцеральных систем, а также оно имеет зоны, проецирующиеся на различные внутренние органы [10, 11], в том числе, на обеспечивающие жизненно важные сердечнососудистые и дыхательные рефлексы [9, 10]. Вентролатеральная часть ядра солитарного тракта входит в состав дорсальной группы респираторных ядер, состоящих, преимущественно, из инспираторных бульбоспинальных нейронов, проецирующихся на спинальные диафрагмальные и межреберные инспираторные мотонейроны, осуществляющие процесс вдоха [7, 10]. Известно, что серотонин принимает непосредственное участие в регуляции респираторной функции [6], однако экспрессия 5-НТТ, как основного фактора, регулирующего его трансмиссию в области продолговатого мозга, а также зависимость экспрессии от содержания самого серотонина, практически не изучены. В связи с этим целью данной работы явилось исследование экспрессии серотонинового транспортера в вентролатеральной части ядра солитарного тракта в ранние сроки постнатального периода в норме и при дефиците серотонина в пренатальный период развития. Материал и методы. Работа выполнена на лабораторных крысах линии Вистар. Содержание животных и все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). В работе использовали метод ингибирования триптофангидроксилазы (фермента синтеза серотонина) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). пХФА в дозе 400 мг/кг самкам крыс (n=5) вводили внутрибрюшинно на 16-е сутки беременности, при этом происходило снижение содержания эндогенного серотонина до 50-80% в период формирования у плодов собственной серотонинергической системы [1, 3]. Головной мозг у крысят исследовали на 5-еи 10-е сутки после рождения. В качестве контроля использовали животных соответствующих сроков развития, полученных от интактных самок (n=3). В каждый срок исследования было использовано по 5-6 как подопытных, так и контрольных крысят. Материал фиксировали в цинк-этанолформальдегиде на фосфатно-солевом буфере (pH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 4-5 мкм. Исследовали ростральную и каудальную области вентрального и латерального субъядер ядра солитарного тракта. Ростральную область вентрального и латерального субъядер исследовали на уровне nucl. facialis (Bregma - 11,64 мм), а каудальную область на уровне nucl. ambiquus (Bregma - 12,00-12,84 мм). Выявление 5-НТТ проводили с использованием первичных anti-Serotonin transporter antibody (AbСam, Великобритания) и вторичных реагентов из набора LSAB2 System-HRP (Dako, Дания). Для визуализации продукта реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Майера (Bio-Optica, Италия) или тионином (Serva, США, Германия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Условия проведения иммуноцитохимической реакции были стандартизированы, все процедуры при иммуноокрашивании гистологических срезов продолговатого мозга, полученных от интактных и подопытных животных в разные сроки развития, осуществляли одновременно. При анализе результатов реакции учитывали окрашивание цитоплазмы нейронов, наличие терминальных варикозных расширений и распределение иммунопозитивных гранул - как предполагаемых мест связывания 5-НТТ [12]. Морфологический анализ и подсчет нейронов проводили на цифровых изображениях серийных срезов разных областей изучаемых субъядер, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). Подсчитывали число иммунопозитивных нейронов на стандартной площади 0,1 мм². Статистическую обработку полученных показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0., ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Ростральная часть вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта. На 5-еи 10-е сутки у контрольных животных в ростральной части вентрального субъядра присутствует по 2,4±0,8 и 2,0±0,7 иммунопозитивных нейронов на стандартной площади среза соответственно. На 5-е сутки в нейропиле визуально определяется довольно высокая плотность сплетения отростков и мелких варикозных расширений (рисунок, а, б). К 10-м суткам происходит снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы нейронов, сокращение количества терминальных варикозных расширений и появление иммунопозитивных пылевидных зерен. На 5-еи 10-е сутки в ростральной части вентрального субъядра при пренатальной недостаточности серотонинергической системы динамика изменений соответствует таковой в контроле. В субъядре обнаруживается по 2,0±0,4 и 1,1±0,9 иммунопозитивных нейронов соответственно. К 10-м суткам, также как в контроле, происходит некоторое снижение интенсивности иммунной реакции цитоплазмы нейронов, сокращение количества терминальных варикозных расширений и появление иммунопозитивных пылевидных зерен. На 5-еи 10-е сутки у животных в контроле в ростральной части латерального субъядра присутствует незначительное число иммунопозитивных нейронов 1,3±0,5 и 1,0±0,7 соответственно. В нейропиле на 5-е сутки плотность сплетения отростков и расположения терминальных варикозных расширений выше, чем на 10-е сутки. При пренатальной недостаточности серотонинергической системы на 5-еи 10-е сутки в латеральном субъядре число иммунопозитивных нейронов составляет 0,8±0,3 и 0,60±0,10 соответственно. В нейропиле динамика изменений соответствует таковой в контроле. Таким образом, у животных в контроле в ростральной области вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, очень мало, их численность на протяжении исследованного периода развития не изменяется. У подопытных крыс, также как в контроле, интенсивность экспрессии 5-НТТ незначительная, и численность иммунопозитивных нейронов соответствует контрольным значениям. Каудальная часть вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта. На 5-е сутки у животных в контроле в каудальной части вентрального субъядра присутствует 8,3±1,4 иммунопозитивных нейронов. В нейропиле обнаруживается плотное сплетение иммунопозитивных тонких терминальных отростков, имеющих множество варикозных расширений и гранул на их поверхности (см. рисунок, в, г). К 10-м суткам (см. рисунок, д, е) число иммунопозитивных нейронов значимо снижается до 5,1±1,5, однако, в нейропиле плотность сети отростков примерно соответствует таковой на 5-е сутки. На 5-е сутки у подопытных животных в каудальной части вентрального субъядра присутствует 4,7±1,4 иммунопозитивных нейронов (на центральных срезах). В нейропиле выявляется довольно плотное сплетение отростков с множеством варикозных расширений и гранул. На 10-е сутки число иммунопозитивных нейронов соответствует таковому на 5-е сутки и составляет 4,5±0,8. В нейропиле морфологическая картина схожа с таковой на 5-е сутки. На 5-е сутки у животных в контроле в каудальной части латерального субъядра на стандартной площади среза присутствует 3,1±1,1 иммунопозитивных нейронов. В нейропиле обнаруживается плотное сплетение терминальных отростков и множество варикозных расширений и гранул. К 10-м суткам число иммунопозитивных нейронов соответствует таковому на 5-е сутки и составляет 2,8±0,9, но в нейропиле плотность сплетения отростков и варикозных расширений снижается. На 5-еи 10-е сутки у подопытных крыс в каудальной части латерального субъядра значимо сокращается число иммунопозитивных нейронов до 1,3±0,6 и 1,0±0,7 соответственно. В нейропиле плотность сплетения отростков и варикозных расширений также снижается по сравнению с контролем. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в ранний постнатальный период в ростральной и каудальной частях вентролатерального отдела ядрá солитарного тракта наблюдается разная динамика экспрессии 5-НТТ. У контрольных и подопытных животных в ростральной части вентрального и латерального субъядер ядрá солитарного тракта число нейронов, синтезирующих 5-НТТ, невелико и с возрастом не изменяется. Вероятно, уровень экспрессии 5-НТТ здесь низкий, и пренатальный дефицит серотонина не оказывает заметного влияния. В каудальной части вентрального субъядра на 5-е сутки после рождения у контрольных животных имеется довольно большое число нейронов, синтезирующих 5-НТТ, что свидетельствует об интенсивной его экспрессии, однако с возрастом (на 10-е сутки) количество таких нейронов резко снижается (почти в 2 раза). Результаты исследования показали, что в ранний постнатальный период в этой области субъядрá при пренатальном дефиците серотонина численность нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, сокращается примерно в 2 раза, она сохраняется таковой до 10-х суток. Вероятно, эти изменения имеют вторичный характер и являются результатом либо нарушения синтетических процессов, вследствие задержки дифференцировки нейронов, либо сокращения афферентных и эфферентных связей в результате недоразвития мишеней. В каудальной части латерального субъядра у контрольных животных на 5-е сутки после рождения число нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, небольшое, но немного, однако, значимо снижающееся к 10-м суткам; у подопытных крыс такие нейроны единичны и с возрастом их количество не изменяется. В каудальной части как вентрального, так и латерального субъядер количество нейронов, экспрессирующих 5-НТТ, почти в 3-3,5 раза больше и, вероятно, уровень экспрессии 5-НТТ здесь значительно выше, чем в ростральной. Представленные наблюдения, по-видимому, могут отражать разную функциональную активность нейронов ростральных и каудальных частей субъядер, однако, следует принимать во внимание особенности строения и организации межнейронных связей в этой области продолговатого мозга. Установлено, что вентролатеральный отдел ядрá солитарного тракта отличается разнообразием поступающих сюда висцеральных афферентных проекций и нисходящих проекций из вышележащих отделов головного мозга. Важная информация для регуляции дыхания поступает в каудальные области респираторных субъядер ядра солитарного тракта как по афферентным волокнам от различных структур, участвующих в процессе дыхания, так и блуждающего нерва [11]. Более того, были установлены обширные эфферентные связи нейронов каудальной части вентролатеральной области с амбигуальным и ретроамбигуальным ядрами (иннервирующими мускулатуру бронхов, сердца, легких, участвующих в регуляции фаз дыхательного цикла), входящими в состав вентральной респираторной группы ядер, а также и с ядрами спинного мозга [2, 9]. В ростральной части, напротив, выявлено небольшое число нейронов, дающих проекции на межреберные респираторные мышцы [4]. Таким образом, результаты исследования показали, что в ранние сроки постнатального развития в вентролатеральной части ядрá солитарного тракта имеет место временная экспрессия серотонинового транспортера, наиболее выраженная в каудальной части вентрального субъядра. Присутствие транспортера предполагает трансмиссию серотонина, который, учитывая множественные афферентные и эфферентные связи с нейронами ядер вентральной респираторной группы и ядрами спинного мозга, может участвовать в регуляции механизмов фаз респираторного цикла. Нарушение экспрессии серотонинового транспортера в вентральном и латеральном субъядрах в ранний постнатальный период, вероятно, может вызывать снижение уровня трансмиссии серотонина, контролирующего деятельность инспираторных нейронов этих субъядер, что, в свою очередь, может быть причиной респираторных нарушений у новорожденных и приводить к апноэ и синдрому внезапной детской смерти.

Об авторах

Людмила Ивановна Хожай

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: astarta0505@mail.ru
лаборатория онтогенеза нервной системы 199034. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Список литературы

Дополнительные файлы