ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССОРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ГИСТОНА Н3 В МЕДИАЛЬНОЙ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ И БАЗОЛАТЕРАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ АМИГДАЛЫ У КРЫС С ГЕНЕТИЧЕСКИМИ РАЗЛИЧИЯМИ ПО ВОЗБУДИМОСТИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Полный текст

Введение. Изучение эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов, лежащих в основе формирования реакций нейронов на патогенный психоэмоциональный стресс, приводящий к развитию психопатологии с длительным течением, активно ведется в последние годы на различных моделях [2]. Одной из них являются селекционные линии крыс с контрастной возбудимостью нервной системы [1]. Долгосрочное эмоциональноболевое стрессорное воздействие приводит к развитию постстрессорных патологических состояний, зависящих от генетически обусловленной возбудимости нервной системы крыс. Их проявление повторяет ряд симптомов, характерных для посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у человека - у низковозбудимых крыс с высоким порогом возбудимости (селекционная линия ВП) и компульсивного расстройства (КР) - у высоковозбудимых крыс с низким порогом возбудимости (селекционная линия НП). ПТСР сопровождается повышенной раздражительностью и агрессией, нарушением памяти и способности к обучению, КР - навязчивыми движениями. Механизмы хронического течения ПТСР и КР в достаточной степени не исследованы. Существует предположение, что в основе долгосрочных патологических изменений при ПТСР и КР лежат длительные эпигенетические (не нарушающие первичную структуру ДНК) модификации генома нейронов эмоциогенных структур мозга, в которых может принимать участие фосфорилирование гистона Н3 [1]. Процессу фосфорилирования гистона Н3 отводится значительная роль в регуляции экспрессии генов [6]. Фосфорилирование заключается в присоединении фосфата с АТФ на гидроксильную группу серина или треонина, что повышает отрицательный заряд и снижает сродство ДНК к гистону, обеспечивая доступ к ДНК регуляторным факторам [3, 8]. В период интерфазы оно приводит к декомпактизации хроматина и наблюдается в активированных промоторах генов, тогда как при делении клетки ведет, напротив, к конденсации хромосом [8]. Несмотря на изучение изменений паттернов фосфорилирования гистона Н3 при стрессе [4, 9], их участие в формировании постстрессорных патологических состояний исследовано недостаточно, особенно в структурах мозга, вовлеченных в реакцию на стресс и связанных с формированием тревожно-депрессивных расстройств. Неизвестен и морфологический субстрат этих изменений в мозге. Ранее нами было показано, что с высокой возбудимостью нервной системы связано возрастание под влиянием стресса уровня фосфорилирования гистона Н3 в клетках сенсомоторной зоны коры, поля CА3 гиппокампа и ретикулярной формации среднего мозга - районах мозга, в которых ранее были выявлены нейроморфологические и нейрофизиологические корреляты высокой возбудимости нервной системы у крыс линии НП [1]. Данные о характере изменений фосфорилирования гистона Н3 по серину 10 (phH3-Ser10) и сроках их сохранения в клетках медиальной префронтальной коры (мПК) и базолатеральной области амигдалы (блА) после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия с учетом особенностей функционального состояния нервной системы и его основного параметра - возбудимости в литературе отсутствуют. Цель работы - иммуногистохимическое исследование уровня фосфорилирования гистона Н3 по серину в положении 10 в нейронах мПК и блА в разные сроки (24 ч, 2 нед, 2 мес) после длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС) у двух линий крыс с генетически детерминированными различиями по возбудимости нервной системы, с дифференциальной, подобной ПТСР и КР, симптоматикой поведения. Материал и методы. Объектом исследования служили 72 крысы из Биоколлекции ФГБУН Института физиологии им. И. П. Павлова РАН (№ ГЗ 0134-2016-0002) - самцы двух селекционных линий крыс: с высоким (линия ВП, n=36) и низким (линия НП, n=36) порогом возбудимости нервной системы (низко-и высоковозбудимые соответственно) [1] в возрасте 5 мес. Крыс выращивали в стандартных условиях вивария лаборатории генетики высшей нервной деятельности ИФ РАН, содержали в условиях стандартного светового режима (12 ч - день, 12 ч - ночь) и свободного доступа к воде и пище. При работе с животными соблюдали международные принципы Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Эксперименты утверждены комиссией по биоэтике ФГБУН Института физиологии им. И. П. Павлова РАН (заключение № 05/03/2020 от 5 марта 2020 г.). Крысы каждой линий были разделены на 6 групп по 6 голов в каждой: 3 группы экспериментальные, животных в которых подвергали ДЭБС, и 3 - контрольные, животных в которых не подвергали никаким воздействиям. Распределение животных по группам осуществляли в соответствии с показателями порога возбудимости и массой тела. ДЭБС осуществляли по схеме К. Гехта: ежедневно в течение 15 сут по 13 мин с межсигнальным интервалом в 1 мин в прозрачную камеру с электрифицированным решетчатым полом подавали 6 неподкрепляемых (10 с) и 6 подкрепляемых электрическим током 2,5 мА (2 мс) световых сигнала c вероятностью подкрепления 0,5 [1]. Животных экспериментальной и контрольной группы каждой линии выводили из эксперимента декапитацией последовательно, в сроки через 24 ч, 2 нед и 2 мес после окончания ДЭБС. Извлекали мозг, из него выделяли образцы, фиксировали их в 4 % растворе параформальдегида и подвергали стандартной гистологической обработке. Иммуногистохимическое исследование проводили на фронтальных срезах мозга (7 мкм) на уровне от +3,24 до +2,52 мм (мПК) и -2,76 мм до -3,24 мм (блА) от брегмы; исследуемая область блА - basolateral amygdaloid nucleus, posterior part - BLP (в соответствии со стереотаксическим атласом мозга крысы [7]). Использовали первичные антитела к гистону Н3, фосфорилированному по серину 10, - p-Histone H3-Ser10 (rabbit polyclonal antibody, Cell Signaling Technology, Netherlands) и вторичные универсальные биотинилированные антитела из Quick Kit (Vector Laboratories, США). Протокол окрашивания, рекомендованный производителем, был модифицирован нами, а именно, подобраны и протестированы концентрации блокировочной сыворотки, первичных и вторичных антител с целью достижения качественной иммуноположительной реакции. Подробный протокол приводим ниже. Парафиновые срезы депарафинировали и подвергали гидратации, проводя через ксилол, спирты убывающей концентрации (100º, 96º, 70º, 40º) и дистиллированную воду. Осуществляли демаскировку (активацию) антигенов путём нанесения на срезы на водяной бане цитратного буфера (pH 6,0) и последующего кипячения в микроволновой печи 2 раза по 5 мин. Отмывали срезы дистиллированной водой, проводили подавление эндогенной пероксидазной активности в 3 % растворе перекиси водорода в течение 30 мин, вновь промывали дистиллированной водой и выдерживали в PBT (фосфатный буфер PBS, pH 7,5) с добавлением 0,1 % детергента Triton) в течение 15 мин для создания уровня pH, необходимого для последующего окрашивания. Блокировку неспецифических антигенов проводили с использованием нормальной лошадиной сыворотки из набора QuickKit (Vector Laboratories, США) и PBT в разведении 1:20. Инкубировали 2 ч при комнатной температуре в закрытом увлажнённом контейнере. На срезы наносили раствор первичных антител в РВТ (разведение 1:100) с добавлением блокировочной сыворотки из QuickKit (разведение 1:40); контролем служили препараты без добавления первичных антител. Препараты инкубировали при 4 ºС в течение ночи, далее выдерживали 1 ч при комнатной температуре, отмывали от раствора первичных антител в PBT и наносили раствор универсальных биотинилированных вторичных антител в разведении 1:100 в РВТ с добавлением блокировочной сыворотки (разведение 1:20). В растворе вторичных антител препараты инкубировали 1 ч при 37 ºС. Затем срезы промывали PBS (pH 7,5) и обрабатывали раствором стрептавидин-пероксидазного комплекса из набора QuickKit в PBS в разведении 1:40 (инкубация в течение 1 ч при 37 ºС). Визуализировали разных линий. Показано повышение phH3-Ser10 реакцию с помощью окрашивания диаминобензидином (3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB) (Peroxidase substratе Kit DAB, Vector Laboratories, США). После окрашивания препараты промывали в дистиллированной воде, проводили по спиртам возрастающей концентрации, ксилолу и заключали в среду «Витрогель». Контрольные препараты дополнительно окрашивали с использованием специфических вторичных антител (biotinylated goat anti-rabbit IgG, Abcam), характер мечения при этом не отличался от такового при использовании основного протокола окрашивания. Оценивали иммуноположительную реакцию клеток, учитывали интенсивно окрашенные ядра с высокой оптической плотностью, высчитывали процент иммуноположительных ядер от общего их числа в мПК и блА. Препараты анализировали с помощью светового микроскопа Микромед-3 (ув. 40-1000), совмещенного с ССDкамерой и программным обеспечением ВидеоТест-FISH (Санкт-Петербург, Россия) и ImageBase. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraphics PLUS 6.0. Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-критерий Манна-Уитни. Различия считали значимыми при p<0,05. Результаты исследования. У низковозбудимых крыс линии ВП в блА обнаружен вдвое более высокий базовый уровень phH3-Ser10 по сравнению с высоковозбудимыми крысами линии НП (рис. 1, б; 3). При этом в мПК межлинейных различий в базовом уровне phH3-Ser10 не обнаружено (см. рис. 1, а; 2). Выявлено влияние ДЭБС на уровень phH3-Ser10 у крыс обеих линий, которое имеет структурную специфичность у животных в мПК, кратковременное (через 24 ч) у крыс линии НП и устойчивое (до 2 мес после воздействия) у животных линии ВП (см. рис. 1, а; 2). В то же время, увеличение уровня phH3-Ser10 в блА обнаружено только у высоковозбудимых крыс линии НП, которое сохранялось до 2 мес (см. рис. 1, б; 3). Обсуждение полученных данных. Из двух исследованных областей мозга в блА выявлена обусловленность базового уровня phH3-Ser10 генетически детерминированным уровнем возбудимости нервной системы крыс: высокий базовый уровень phH3-Ser10 связан с низкой возбудимостью нервной системы (линия крыс ВП) и, напротив, низкий базовый уровень phH3-Ser10 - с высокой возбудимостью (линия крыс НП). Важно отметить, что ранее нами был выявлен аналогичный характер межлинейных различий в уровне иммуноположительных к phH3-Ser10 клеток в поле СА3 гиппокампа и ретикулярной формации среднего мозга крыс указанных линий ВПи НП [1]. В целом, степень фосфорилирования гистона Н3 может быть одной из эпигенетических составляющих, связанных с генетически детерминированной функциональной активностью ЦНС в областях мозга с обусловленными высокой и низкой возбудимостью нейрофизиологическими и морфологическими различиями [1]. Полученные нами данные свидетельствуют также о дифференциальном долгосрочном влиянии ДЭБС на phH3-Ser10 в клетках мПК и блА, зависимом от уровня возбудимости животных исследуемых линий. В мПК у низковозбудимых крыс линии ВП наблюдается долгосрочное (до 2 мес) постстрессорное повышение phH3-Ser10, тогда как у высоковозбудимых крыс линии НП - кратковременное (до 24 ч). При этом у крыс линии НП имеет место долговременное повышение phH3-Ser10 в блА. Эти изменения отражают активируемые стрессом патологические эпигенетические паттерны модификации хроматина, которые могут влиять и на линейную специфику долгосрочных нарушений поведения [1]. Разный характер межлинейных различий в интенсивности базовой иммунореактивности к phH3-Ser10 и особенности ее изменения под влиянием принудительного плавания отмечен в лимбических областях мозга также у чувствительных и устойчивых к стрессу крыс линий RLA и RHA, выведенных на основе отбора по эффективности формирования реакции избегания болевого стимула (электрический ток) в челночной камере [4]. Известно, что именно психологический, но не другие виды стресса (эфирный наркоз, холод) вызывают изменения phH3-Ser10 в зрелых нейронах гиппокампа крыс [9]. Такие стрессорные воздействия, как принудительное плавание (forced swimm stress) и стресс новизны (novelty stress), индуцируют ремоделирование хроматина за счет фосфорилирования гистона Н3 в клетках зубчатой извилины гиппокампа при участии сигнальных путей, включающих глюкокортикоидные и НМДА-рецепторы, митоген-активируемую протеинкиназу (mitogen-activated protein kinase-MAPK), MAP-киназу, ERK (extracellular signal-regulated kinase), MSK (mitogen and stress-activated kinase) [2, 4]. Поскольку у исследуемых нами линий крыс с контрастной возбудимостью нервной системы ранее были обнаружены особенности в глюкокортикоидной и глутаматной рецепции, можно предположить связь этих систем с выявленными как в данной работе, так и ранее, особенностями паттернов фосфорилирования гистона Н3 в клетках разных структур мозга. Для выявления конкретного вклада этих сигнальных путей в патогенез постстрессорных дезадаптивных состояний, зависимых от возбудимости нервной системы, в экспериментальных моделях ПТСР и КР требуются специальные исследования. Таким образом, фосфорилирование гистона Н3 по серину в положении 10 в мПК и блА может являться эпигенетическим звеном патогенеза постстрессорных расстройств, связанных с возбудимостью нервной системы. При этом известно, что phH3-Ser10 оказывает влияние и на другие эпигенетические модификации и факторы ремоделирования хроматина [8]. Обобщая данные настоящего исследования и сопоставляя их с ранее полученными результатами, можно заключить: спектр, возможно, взаимодействующих долгосрочных постстрессорных эпигенетических изменений включает, наряду с ацетилированием и метилированием гистонов, метилированием ДНК [1], также фосфорилирование гистона Н3 (серин 10), изменение которого также имеет структурно-временную специфичность, зависимую от генетически обусловленной возбудимости нервной системы. Следует отметить, что повышение phH3-Ser10 связано с гипервозбудимостью нейронов, например, в моделях эпилепсии, индуцируемой пилокарпином и каинатом [5]. Возможно вследствие экстраординарного повышения возбудимости в условиях ДЭБС происходит преимущественный рост phH3-Ser10 (гиппокамп, амигдала, ретикулярная формация среднего мозга) и у высоковозбудимых крыс с НП и именно в тех областях мозга, где были зафиксированы значения высокой базовой возбудимости. Однако у интактных животных не выявлено положительной корреляции между уровнем возбудимости и степенью фосфорилирования гистона Н3. Заключение. В целом, полученные результаты уточняют понимание генетических и эпигенетических механизмов формирования долговременных стресс-зависимых тревожнодепрессивных патологий (посттравматического и компульсивного расстройств), способствуют выявлению эпигенетических мишеней действия стресса в определенных районах мозга для разработки таргентных терапевтических технологий на основе персонифицированного подхода, учитывающего особенности функционального состояния нервной системы. Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий (ГП- 14, раздел 65) и частично по гранту РФФИ № 18-34- 01024 (приобретение оборудования для содержания и тестирования крыс коллекционных линий и некоторых реактивов для иммуногистохимии). Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. И. В. Сбор и обработка материала: М. Б. П., А. С. Л., Д. А.-А. Х. Статистическая обработка данных: М. Б. П. Анализ и интерпретация данных: Н. А. Д. Написание текста: Н. А. Д., М. Б. П., А. И. В. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Наталья Алековна Дюжикова

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: dyuzhikova@infran.ru
лаборатория генетики высшей нервной деятельности 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Марина Борисовна Павлова

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

лаборатория генетики высшей нервной деятельности 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Анна Сергеевна Левина

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

лаборатория генетики высшей нервной деятельности 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Диана Азрет-Алиевна Хлебаева

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

лаборатория генетики высшей нервной деятельности 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Александр Иванович Вайдо

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

лаборатория генетики высшей нервной деятельности 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Список литературы

Дополнительные файлы