МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТОАРХИТЕКТОНИКИ СЕЛЕЗЕНКИ ЧЕЛОВЕКА

Полный текст

Введение. В исследованиях, посвященных изучению иммунного ответа на различные воздействия, часто возникает необходимость оценить структурные особенности селезенки с помощью морфометрических методов. Интер­претация морфологических данных в сопоставлении с различными этапами иммунного ответа обусловливает понимание реакций, происхо­дящих в этом сложном органе [1, 5, 7, 11, 13]. Цель работы - определить морфометрическую характеристику гистоархитектоники селезенки человека. Материал и методы. Аутопсийные образцы селезенок получены у 20 человек (12 мужчин, 8 женщин), скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови и другой патологии органа (Кировский НИИ гематологии и переливания крови). Медиана возраста составила 39 (27; 65) лет. Группировка по полу и возрасту не была проведена в связи с малочисленностью выборки. Средняя масса селезенки составила 122,5 (115; 143,8) г. Исследование проведено в соответствии с современными принципами биомедицинской этики и безопасности клинических исследований (протокол заседания локального этического комитета при ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России № 4, 20.02.2018 г.). Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Парафиновые гистологические срезы ткани селезенки толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином по стандартной методике. Для дифференцировки В- и Т-клеточных зон белой пульпы (БП) селезенки, а также для изучения особенностей распределения основных клеточных популяций в функциональных зонах органа использовалось иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание первичными антителами фирм Dako (Дания) и BioGenex (США) в готовых разведениях. Применялась система визуализации EnVISION, PEROXIDASE (DAB+) фирмы Dako (Дания) (табл. 1). Морфометрию проводили с помощью светового микро­скопа Leica (Германия) со встроенной фотовидеокамерой и программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color (версия М). Для вычисления размеров БП и красной пульпы (КП) микрофотосъемку проводили цифровой камерой в 20 полях зрения для каждого образца по направлению от капсулы вглубь селезенки. Исследование размеров компартментов БП выполняли в не менее 20 фолликулярных структурах на каждом препарате. Для измерения площади функциональных зон и числа клеток использовали пункт меню «Ручное выделение объектов». Средние площади БП и КП определяли при ув. 100; средние площади периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ), маргинальной зоны (МЗ), лимфоидных узелков (ЛУ) и герминативных центров (ГЦ) измеряли при ув. 200, цитоморфометрию проводили при ув. 1000. Программа автоматически измеряет площадь, занимаемую тем или иным компартментом в процентах к общей исследуемой площади среза. Аналогично определялись и относительные количественные значения клеточного состава. Пересчет показателей в абсолютные значения с учетом массы органа выполнялся по авторским оригинальным и запатентованным методикам [5, 6], патент на изобретение № 2535059 от 08.10.2014 г. Исходя из полученных относительных значений (в %), полученных при морфометрии, вычисляли массу БП и КП селезенки по формулам: b=mсел×D%/100%, где b - масса БП (г), mсел - общая масса селезенки (г), D - средняя площадь БП, %; p=mсел ×G%/100%, где p - масса КП (г), G - средняя площадь KП, %. Размеры компартментов БП вычисляли аналогичным способом из относительных значений, полученных при морфометрии и пересчете в абсолютные показатели с учетом массы органа. Вычисления абсолютного значения клеточных элементов производили согласно патенту на изобретение № 2599021 от 08.09.2016 г. Далее эти же образцы с ИГХ-окрашиванием (например: В-лимфоциты СD20+) исследовали морфометрически с помощью той же программы, подсчитывая относительные значения числа клеток, экспрессирующих данный маркер, отдельно в каждой функциональной зоне (в БП и КП). Исходя из полученных результатов, вычисляли массу В-лимфоцитов в БП селезенки по формуле: U=b×C%/100%, где b - масса БП (г), U - масса В-лимфоцитов в БП (г), С - среднее содержание В-лимфоцитов (%) в БП. Затем вычисляли массу В-лимфоцитов в КП селезенки по формуле: Z=p×J%/100%, где p - масса КП (г), Z - масса В-лимфоцитов в KП (г), J - среднее содержание В-лимфоцитов (%) в KП. Таким образом, содержание В-лимфоцитов в селезенке будет соответствовать: X=U+Z, где X - содержание В-лимфоцитов в селезенке (г); Y=X×100%/mсел, где Y - среднее содержание В-лимфоцитов в селезенке (%). Получение абсолютных значений наиболее полно отражает объем изучаемых объектов и может быть использовано для анализа реакций, происходящих в селезенке на разных этапах иммунного ответа. Для статистической обработки применялась программа IBM SPSS Statistics 23. Для выявления различий между показателями в сравниваемых группах использовали непараметрические двусторонние критерии Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни с учетом поправки Бонферони при множественных сравнениях. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследований представлены с указанием медианы, а также нижнего (25%) и верхнего (75%) квартиля. Результаты исследования. При изучении особенностей гистоархитектоники селезенки человека были использованы морфометрические показатели величин компартментов БП в относительных (%) и абсолютных (г) значениях, а также размеры КП (табл. 2, 3). Установлено, что колебания размеров пара­мет­ров, составляющих БП и КП, зависят от степени активности иммунных процессов, происходящих в компартментах этих зон на различных этапах иммунного ответа. На 1-м этапе иммунного ответа гистоархи­тектоника селезенки характеризуется расширением БП за счет МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, при умеренно-клеточной КП. На 2-м этапе иммунного ответа продолжается расширение МЗ, в ЛУ происходит формирование герминативных центров, увеличиваются размеры ПАЛМ (рис. 1, 2). ПАЛМ, являясь Т-зависимой зоной БП селезенки, содержат Т-лимфоциты (CD3), среди которых преобладают CD4+-клетки. В меньшем количестве встречаются лимфоидные элементы, экспрессирующие CD8+. Изменение размеров этой зоны отражает степень активности Т-клеточных процессов, происходящих в БП (рис. 3). На величину ЛУ влияют вид антигена, его доза и время персистирования в организме. Функциональная активность ЛУ определяется тем, на какой стадии развития находятся их ГЦ. В период активности ГЦ данная область увеличивается. Уменьшение параметра связано с процессом обратного развития ГЦ. Величина площади КП селезенки на разных этапах иммунного ответа также претерпевает существенные изменения (табл. 4). Медиана величины массы капсулы, трабекул и сосудов составляла 15,95 (15,0; 18,72) г. Расширение этой функциональной зоны может быть обусловлено ее повышенным кровенапол­нением или увеличением клеточного состава в пульпарных тяжах вследствие миграции иммуноком­петентных клеток (ИКК) (рис. 4). Обратные процессы ведут к уменьшению размеров КП селезенки. Определение содержания клеточного состава в функциональных зонах селезенки было выполнено также в относительных (%) и абсолютных значениях (г). Данные количественного состава основных популяций ИКК в функциональных зонах селезенки представлены в табл. 5. Установлено, что CD20+-В-клетки в относительных цифрах преобладают в БП (р<0,05). В абсолютных значениях число В-лимфоцитов в БП и КП не имело значимых различий. Показатели общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+) в процентном содержании также были больше в БП по сравнению с КП, а при пересчете с учетом массы органа и функциональных зон существенное преобладание данных клеток в КП не выявлено. При сравнении содержания субпопуляции CD4+-Т-хелперов определялось значимое увеличение его в БП в относительных значениях по отношению к КП, а абсолютные показатели были существенно выше в КП. Процентное содержание цитотоксических CD8+-Т-лимфоцитов в КП значимо превышало таковое в БП. Преимущественной зоной локализации популяции макрофагов (CD68) является КП, что подтверждается как относительными, так и абсолютными показателями. Обсуждение полученных данных. В исследуемом гистологическом материале селезенок при помощи ИГХ и морфометрии полу­чены численные значения площадей компарт­ментов функциональных зон, а также популяций ИКК, которые выявлялись в различных количествах в отделах пульпы. Наши данные о составе клеточных элементов в селезенке соответствуют результатам исследований этого иммунного органа при различных воздействиях [1, 2, 4]. В то же время, оценить в каждом отдельном случае реактивные изменения, происходящие в селезенке, невозможно без четкого понимания миграционных свойств ИКК в комплексном сопоставлении с функциями данных клеток на этапах иммунного ответа. Эти явления имеют морфологическое отражение в изменениях размеров компартментов, участвующих в иммунных процессах. В соответствии с полученными данными нам представляется возможным выделить три этапа течения иммунореактивных процессов в функциональных зонах селезенки. Этапы иммунного ответа определялись в процессе сопоставления гистологического и иммуногистохимического исследования структуры селезенки с морфометрическими показателями размеров функциональных зон. 1 этап - распознавание антигена. Поступление в селезенку антигенов, свободных или связанных с антиген-презентирующими клетками (АПК). Известно, что возможные пути попадания антигенов в различные отделы селезенки чаще всего зависят от вида антигена. Антигены в МЗ взаимодействуют как с макрофагами, так и с B-лимфоцитами, что подтверждается иссле­дованиями многих авторов [7, 9, 11]. Следовательно, гистоархитектоника селезенки на данном этапе характеризуется: широкой МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, умеренно-клеточной КП (см. рис. 2, 3). 2 этап - формирование эффекторов: развитие иммунных реакций, презентация обработанных антигенов Т-хелперам; выбор пути дифференцировки CD4+-Т-клеток в направлении Th1- или Th2-хелперов; развитие гуморального иммунного ответа. Для первичного иммунного ответа активация Т-хелперов зависит от взаимодействия с АПК (ДК, макрофаги, В-лимфоциты), приносящими анти­гены в ПАЛМ. Узнавание антигенов Т-клеточ­ны­ми рецепторами обеспечивает первый сигнал ак­тивации Т-клеток [7, 12]. Поскольку АПК рециркулируют через ПАЛМ или MЗ с дальнейшей их миграцией в ПАЛМ, антигенспецифический сигнал эти клетки передают Т-хелперам для запуска тимусзависимого гуморального, а также цитотоксического Т-клеточного иммунных ответов. В ПАЛМ чаще всего образуются Th1, которые не нуждаются в представлении антигена В-лимфоцитами, тогда как в зонах контакта В- и Т-клеток образуются в основном Th2-клетки [8, 10, 15]. Гуморальный иммунный ответ развивается после того, как В-лимфоцит получает специфический антигенный сигнал и ряд дополнительных сигналов от Т-хелперов [7, 10]. В результате происходят активация В-лимфоцитов, их пролиферация и дифференцировка [12, 15]. Индукция антителообразования структурно связана с ГЦ, реагирующими на антигенную стиму­ляцию. После того как ограниченные в ЛУ активизированные В-лимфоциты взаимодейст­вуют с антигеном происходит их дальнейшая стиму­ляция, вызывающая увеличение ГЦ [12, 14, 15]. В связи с описанными механизмами развития иммунных процессов нами определены характерные особенности селезенки на этом этапе: увеличение БП, преимущественно за счет МЗ, ПАЛМ и ЛУ с ГЦ. КП - умеренно-клеточная (см. рис. 1, 2). 3 этап - эффекторная часть иммунного ответа. Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов. Бласттрансформированные В-клет­ки дифференцируются в клетки памяти и плазматические клетки, секретирующие антитела. Зна­чительная часть плазматических клеток мигрируют в МЗ и КП селезенки, а затем покидают этот лимфоидный орган [14, 15]. Субпопуляция Th1 CD4+-Т-лим­фоцитов (эффекторные Т-клетки) в центральных ПАЛМ секретирует провоспалительные цитокины (типа интерферона-γ), что способствует разнообразным воспалительным реакциям. Эти клеточные элементы могут поступать в КП и затем мигрировать к участкам депонирования антигена на периферии [13, 14]. Точно также CD8+-Т-лимфоциты рециркулируют через ПАЛМ и, если они входят в контакт с родственным антигеном на АПК, они активируются, клонально пролиферируют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты. Образующиеся эффекторные Т-клетки (CD8+) имеют большое значение в разнообразных реакциях организма, включая отторжение аллотранс­плантата, защиту против многих вирусных инфекций и в аутоиммунных процессах [12]. В соответствии с результатами настоящего исследования на 3 этапе развития иммунных реакций в селезенке уменьшаются размеры БП: МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ претерпевают стадию обратного развития, а площадь КП расширяется за счет увеличения ее клеточного состава (см. рис. 4). Поглощение антигенов клетками стромы КП важно не только для деструкции патогенов, но и является первым этапом в индукции как первичного, так и вторичного иммунного ответа [3, 11]. Задержка антигенов в КП, прикрепление к ним антител формируют иммунные комплексы, которые через Fc-области Ig взаимо­действуют с рецепторами на фагоцитах и других клетках стромы органа. Опсонизированные антителами циркулирующие антигены вовлекают в фагоцитоз FcR-положительные клетки, включая макрофаги и нейтрофилы КП [2, 11]. Заключение. Для исследования гис­тоархитек­тоники селезенки важно учитывать особенности миграции клеточных элементов, динамику и численность их распределения в БП и КП на основных этапах иммунного ответа, что, несомненно, влияет на массу органа и, соответственно, его функциональных компартментов. Морфометрическое исследование селезенки с использованием параметров величины ее массы является достаточно объективным и рациональным. Представленные базовые параметры необходимы при анализе морфологических изменений селезенки в диагностике заболеваний с поражением органов иммунной системы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Н. С. Ф. Сбор и обработка материала: Н. С. Ф., Д. А. Д. Ста тистическая обработка данных: Д. А. Д., Е. В. К. Ана лиз и интерпретация данных: Н. С. Ф., Л. М. Ж., В. Б. З. Нап исание и редактирование текста: Н. С. Ф., Л. М. Ж., В. Б. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Надежда Станиславовна Федоровская

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: fednadst@mail.ru
Лаборатория патоморфологии 610027, г. Киров, ул. Красноармейская, 72

Лев Михайлович Железнов

Кировский государственный медицинский университет

Email: lmz-a@mail.ru
кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии 610998, г. Киров, ул. К. Маркса, 112

Валерий Борисович Зайцев

Кировский государственный медицинский университет

Email: kf7@kirovgma.ru
кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии 610998, г. Киров, ул. К. Маркса, 112

Дмитрий Андреевич Дьяконов

Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови

Email: diakonovda@rambler.ru
Лаборатория патоморфологии 610027, г. Киров, ул. Красноармейская, 72

Елена Владимировна Коледаева

Кировский государственный медицинский университет

Email: kf4@kirovgma.ru
кафедра биологии

Список литературы

Дополнительные файлы