MORPHOMETRIC CHARACTERISTIC OF HISTOARCHITECTONICS OF THE HUMAN SPLEEN

Full Text

Введение. В исследованиях, посвященных изучению иммунного ответа на различные воздействия, часто возникает необходимость оценить структурные особенности селезенки с помощью морфометрических методов. Интер­претация морфологических данных в сопоставлении с различными этапами иммунного ответа обусловливает понимание реакций, происхо­дящих в этом сложном органе [1, 5, 7, 11, 13]. Цель работы - определить морфометрическую характеристику гистоархитектоники селезенки человека. Материал и методы. Аутопсийные образцы селезенок получены у 20 человек (12 мужчин, 8 женщин), скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови и другой патологии органа (Кировский НИИ гематологии и переливания крови). Медиана возраста составила 39 (27; 65) лет. Группировка по полу и возрасту не была проведена в связи с малочисленностью выборки. Средняя масса селезенки составила 122,5 (115; 143,8) г. Исследование проведено в соответствии с современными принципами биомедицинской этики и безопасности клинических исследований (протокол заседания локального этического комитета при ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России № 4, 20.02.2018 г.). Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Парафиновые гистологические срезы ткани селезенки толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином по стандартной методике. Для дифференцировки В- и Т-клеточных зон белой пульпы (БП) селезенки, а также для изучения особенностей распределения основных клеточных популяций в функциональных зонах органа использовалось иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание первичными антителами фирм Dako (Дания) и BioGenex (США) в готовых разведениях. Применялась система визуализации EnVISION, PEROXIDASE (DAB+) фирмы Dako (Дания) (табл. 1). Морфометрию проводили с помощью светового микро­скопа Leica (Германия) со встроенной фотовидеокамерой и программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color (версия М). Для вычисления размеров БП и красной пульпы (КП) микрофотосъемку проводили цифровой камерой в 20 полях зрения для каждого образца по направлению от капсулы вглубь селезенки. Исследование размеров компартментов БП выполняли в не менее 20 фолликулярных структурах на каждом препарате. Для измерения площади функциональных зон и числа клеток использовали пункт меню «Ручное выделение объектов». Средние площади БП и КП определяли при ув. 100; средние площади периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ), маргинальной зоны (МЗ), лимфоидных узелков (ЛУ) и герминативных центров (ГЦ) измеряли при ув. 200, цитоморфометрию проводили при ув. 1000. Программа автоматически измеряет площадь, занимаемую тем или иным компартментом в процентах к общей исследуемой площади среза. Аналогично определялись и относительные количественные значения клеточного состава. Пересчет показателей в абсолютные значения с учетом массы органа выполнялся по авторским оригинальным и запатентованным методикам [5, 6], патент на изобретение № 2535059 от 08.10.2014 г. Исходя из полученных относительных значений (в %), полученных при морфометрии, вычисляли массу БП и КП селезенки по формулам: b=mсел×D%/100%, где b - масса БП (г), mсел - общая масса селезенки (г), D - средняя площадь БП, %; p=mсел ×G%/100%, где p - масса КП (г), G - средняя площадь KП, %. Размеры компартментов БП вычисляли аналогичным способом из относительных значений, полученных при морфометрии и пересчете в абсолютные показатели с учетом массы органа. Вычисления абсолютного значения клеточных элементов производили согласно патенту на изобретение № 2599021 от 08.09.2016 г. Далее эти же образцы с ИГХ-окрашиванием (например: В-лимфоциты СD20+) исследовали морфометрически с помощью той же программы, подсчитывая относительные значения числа клеток, экспрессирующих данный маркер, отдельно в каждой функциональной зоне (в БП и КП). Исходя из полученных результатов, вычисляли массу В-лимфоцитов в БП селезенки по формуле: U=b×C%/100%, где b - масса БП (г), U - масса В-лимфоцитов в БП (г), С - среднее содержание В-лимфоцитов (%) в БП. Затем вычисляли массу В-лимфоцитов в КП селезенки по формуле: Z=p×J%/100%, где p - масса КП (г), Z - масса В-лимфоцитов в KП (г), J - среднее содержание В-лимфоцитов (%) в KП. Таким образом, содержание В-лимфоцитов в селезенке будет соответствовать: X=U+Z, где X - содержание В-лимфоцитов в селезенке (г); Y=X×100%/mсел, где Y - среднее содержание В-лимфоцитов в селезенке (%). Получение абсолютных значений наиболее полно отражает объем изучаемых объектов и может быть использовано для анализа реакций, происходящих в селезенке на разных этапах иммунного ответа. Для статистической обработки применялась программа IBM SPSS Statistics 23. Для выявления различий между показателями в сравниваемых группах использовали непараметрические двусторонние критерии Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни с учетом поправки Бонферони при множественных сравнениях. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследований представлены с указанием медианы, а также нижнего (25%) и верхнего (75%) квартиля. Результаты исследования. При изучении особенностей гистоархитектоники селезенки человека были использованы морфометрические показатели величин компартментов БП в относительных (%) и абсолютных (г) значениях, а также размеры КП (табл. 2, 3). Установлено, что колебания размеров пара­мет­ров, составляющих БП и КП, зависят от степени активности иммунных процессов, происходящих в компартментах этих зон на различных этапах иммунного ответа. На 1-м этапе иммунного ответа гистоархи­тектоника селезенки характеризуется расширением БП за счет МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, при умеренно-клеточной КП. На 2-м этапе иммунного ответа продолжается расширение МЗ, в ЛУ происходит формирование герминативных центров, увеличиваются размеры ПАЛМ (рис. 1, 2). ПАЛМ, являясь Т-зависимой зоной БП селезенки, содержат Т-лимфоциты (CD3), среди которых преобладают CD4+-клетки. В меньшем количестве встречаются лимфоидные элементы, экспрессирующие CD8+. Изменение размеров этой зоны отражает степень активности Т-клеточных процессов, происходящих в БП (рис. 3). На величину ЛУ влияют вид антигена, его доза и время персистирования в организме. Функциональная активность ЛУ определяется тем, на какой стадии развития находятся их ГЦ. В период активности ГЦ данная область увеличивается. Уменьшение параметра связано с процессом обратного развития ГЦ. Величина площади КП селезенки на разных этапах иммунного ответа также претерпевает существенные изменения (табл. 4). Медиана величины массы капсулы, трабекул и сосудов составляла 15,95 (15,0; 18,72) г. Расширение этой функциональной зоны может быть обусловлено ее повышенным кровенапол­нением или увеличением клеточного состава в пульпарных тяжах вследствие миграции иммуноком­петентных клеток (ИКК) (рис. 4). Обратные процессы ведут к уменьшению размеров КП селезенки. Определение содержания клеточного состава в функциональных зонах селезенки было выполнено также в относительных (%) и абсолютных значениях (г). Данные количественного состава основных популяций ИКК в функциональных зонах селезенки представлены в табл. 5. Установлено, что CD20+-В-клетки в относительных цифрах преобладают в БП (р<0,05). В абсолютных значениях число В-лимфоцитов в БП и КП не имело значимых различий. Показатели общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+) в процентном содержании также были больше в БП по сравнению с КП, а при пересчете с учетом массы органа и функциональных зон существенное преобладание данных клеток в КП не выявлено. При сравнении содержания субпопуляции CD4+-Т-хелперов определялось значимое увеличение его в БП в относительных значениях по отношению к КП, а абсолютные показатели были существенно выше в КП. Процентное содержание цитотоксических CD8+-Т-лимфоцитов в КП значимо превышало таковое в БП. Преимущественной зоной локализации популяции макрофагов (CD68) является КП, что подтверждается как относительными, так и абсолютными показателями. Обсуждение полученных данных. В исследуемом гистологическом материале селезенок при помощи ИГХ и морфометрии полу­чены численные значения площадей компарт­ментов функциональных зон, а также популяций ИКК, которые выявлялись в различных количествах в отделах пульпы. Наши данные о составе клеточных элементов в селезенке соответствуют результатам исследований этого иммунного органа при различных воздействиях [1, 2, 4]. В то же время, оценить в каждом отдельном случае реактивные изменения, происходящие в селезенке, невозможно без четкого понимания миграционных свойств ИКК в комплексном сопоставлении с функциями данных клеток на этапах иммунного ответа. Эти явления имеют морфологическое отражение в изменениях размеров компартментов, участвующих в иммунных процессах. В соответствии с полученными данными нам представляется возможным выделить три этапа течения иммунореактивных процессов в функциональных зонах селезенки. Этапы иммунного ответа определялись в процессе сопоставления гистологического и иммуногистохимического исследования структуры селезенки с морфометрическими показателями размеров функциональных зон. 1 этап - распознавание антигена. Поступление в селезенку антигенов, свободных или связанных с антиген-презентирующими клетками (АПК). Известно, что возможные пути попадания антигенов в различные отделы селезенки чаще всего зависят от вида антигена. Антигены в МЗ взаимодействуют как с макрофагами, так и с B-лимфоцитами, что подтверждается иссле­дованиями многих авторов [7, 9, 11]. Следовательно, гистоархитектоника селезенки на данном этапе характеризуется: широкой МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, умеренно-клеточной КП (см. рис. 2, 3). 2 этап - формирование эффекторов: развитие иммунных реакций, презентация обработанных антигенов Т-хелперам; выбор пути дифференцировки CD4+-Т-клеток в направлении Th1- или Th2-хелперов; развитие гуморального иммунного ответа. Для первичного иммунного ответа активация Т-хелперов зависит от взаимодействия с АПК (ДК, макрофаги, В-лимфоциты), приносящими анти­гены в ПАЛМ. Узнавание антигенов Т-клеточ­ны­ми рецепторами обеспечивает первый сигнал ак­тивации Т-клеток [7, 12]. Поскольку АПК рециркулируют через ПАЛМ или MЗ с дальнейшей их миграцией в ПАЛМ, антигенспецифический сигнал эти клетки передают Т-хелперам для запуска тимусзависимого гуморального, а также цитотоксического Т-клеточного иммунных ответов. В ПАЛМ чаще всего образуются Th1, которые не нуждаются в представлении антигена В-лимфоцитами, тогда как в зонах контакта В- и Т-клеток образуются в основном Th2-клетки [8, 10, 15]. Гуморальный иммунный ответ развивается после того, как В-лимфоцит получает специфический антигенный сигнал и ряд дополнительных сигналов от Т-хелперов [7, 10]. В результате происходят активация В-лимфоцитов, их пролиферация и дифференцировка [12, 15]. Индукция антителообразования структурно связана с ГЦ, реагирующими на антигенную стиму­ляцию. После того как ограниченные в ЛУ активизированные В-лимфоциты взаимодейст­вуют с антигеном происходит их дальнейшая стиму­ляция, вызывающая увеличение ГЦ [12, 14, 15]. В связи с описанными механизмами развития иммунных процессов нами определены характерные особенности селезенки на этом этапе: увеличение БП, преимущественно за счет МЗ, ПАЛМ и ЛУ с ГЦ. КП - умеренно-клеточная (см. рис. 1, 2). 3 этап - эффекторная часть иммунного ответа. Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов. Бласттрансформированные В-клет­ки дифференцируются в клетки памяти и плазматические клетки, секретирующие антитела. Зна­чительная часть плазматических клеток мигрируют в МЗ и КП селезенки, а затем покидают этот лимфоидный орган [14, 15]. Субпопуляция Th1 CD4+-Т-лим­фоцитов (эффекторные Т-клетки) в центральных ПАЛМ секретирует провоспалительные цитокины (типа интерферона-γ), что способствует разнообразным воспалительным реакциям. Эти клеточные элементы могут поступать в КП и затем мигрировать к участкам депонирования антигена на периферии [13, 14]. Точно также CD8+-Т-лимфоциты рециркулируют через ПАЛМ и, если они входят в контакт с родственным антигеном на АПК, они активируются, клонально пролиферируют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты. Образующиеся эффекторные Т-клетки (CD8+) имеют большое значение в разнообразных реакциях организма, включая отторжение аллотранс­плантата, защиту против многих вирусных инфекций и в аутоиммунных процессах [12]. В соответствии с результатами настоящего исследования на 3 этапе развития иммунных реакций в селезенке уменьшаются размеры БП: МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ претерпевают стадию обратного развития, а площадь КП расширяется за счет увеличения ее клеточного состава (см. рис. 4). Поглощение антигенов клетками стромы КП важно не только для деструкции патогенов, но и является первым этапом в индукции как первичного, так и вторичного иммунного ответа [3, 11]. Задержка антигенов в КП, прикрепление к ним антител формируют иммунные комплексы, которые через Fc-области Ig взаимо­действуют с рецепторами на фагоцитах и других клетках стромы органа. Опсонизированные антителами циркулирующие антигены вовлекают в фагоцитоз FcR-положительные клетки, включая макрофаги и нейтрофилы КП [2, 11]. Заключение. Для исследования гис­тоархитек­тоники селезенки важно учитывать особенности миграции клеточных элементов, динамику и численность их распределения в БП и КП на основных этапах иммунного ответа, что, несомненно, влияет на массу органа и, соответственно, его функциональных компартментов. Морфометрическое исследование селезенки с использованием параметров величины ее массы является достаточно объективным и рациональным. Представленные базовые параметры необходимы при анализе морфологических изменений селезенки в диагностике заболеваний с поражением органов иммунной системы. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Н. С. Ф. Сбор и обработка материала: Н. С. Ф., Д. А. Д. Ста тистическая обработка данных: Д. А. Д., Е. В. К. Ана лиз и интерпретация данных: Н. С. Ф., Л. М. Ж., В. Б. З. Нап исание и редактирование текста: Н. С. Ф., Л. М. Ж., В. Б. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. S. Fedorovskaya

Kirov Scientific Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of Federal Medical and Biologic Agency

Email: fednadst@mail.ru
Laboratory of Pathomorphology 72 Krasnoarmeyskaya St., Kirov 610027, Russia

L. M. Zheleznov

Kirov State Medical University

Email: lmz-a@mail.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology 112 K. Marksa St., Kirov 610998, Russia

V. B. Zaitsev

Kirov State Medical University

Email: kf7@kirovgma.ru
Department of Histology, Embryology and Cytology 112 K. Marksa St., Kirov 610998, Russia

D. A. Diakonov

Kirov Scientific Research Institute of Hematology and Blood Transfusion of Federal Medical and Biologic Agency

Email: diakonovda@rambler.ru
Laboratory of Pathomorphology 72 Krasnoarmeyskaya St., Kirov 610027, Russia

Ye. V. Koledaeva

Kirov State Medical University

Email: kf4@kirovgma.ru
Department of Biology 112 K. Marksa St., Kirov 610998, Russia

References

Supplementary files