АЛЬТЕРАЦИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ И ЛИМФОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК (ИССЛЕДОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ)

Полный текст

Синтез большого числа новых классов наноматериалов и увеличение их экологической нагрузки, а также попытки их внедрения в медицинскую практику с целью терапии и диагностики делают особенно актуальной проблему исследования токсичности наночастиц (НЧ) [12]. При любом механизме введения НЧ неизбежно обнаруживаются в крови, где происходит их взаимодействие как с эритроцитами, так и с клетками лейкоцитарной фракции [2]. Поскольку лимфоциты (ЛФ) связывают на своей поверхности, а нейтрофильные гранулоциты (НГ) способны напрямую фагоцитировать агрегаты НЧ [10, 11], важно знать, к каким морфологическим изменениям клеток это приводит, и какие механизмы клеточной гибели могут запускаться в результате такого взаимодействия. В настоящее время Номенклатурный комитет по клеточной гибели (Nomenclature Committee on Cell Death) официально выделяет 12 типов смерти клеток на основании морфологических, биохимических, функциональных, генетических и фармакологических особенностей [6]. Механизм клеточной гибели может напрямую влиять на развитие физиологических и ряда патологических процессов [3]. Для морфологической идентификации разных вариантов альтерации клеток и их гибели необходимо использовать современные методы высокоразрешающей микроскопии. Наибольшими преимуществами обладает атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая не требует сложной пробоподготовки и позволяет провести большое число морфометрических измерений [4]. Целью данной работы были анализ основных параметров НГ и ЛФ для оценки степени их альтерации квантовыми точками (КТ) с разным покрытием и описание основных видов клеточной гибели, развивающихся в результате такого взаимодействия. Материал и методы. Исследовали 31 образец венозной крови здоровых доноров обоих полов в возрасте 20-47 лет, полученных из «Нижегородского областного центра крови им. Н. Я. Климовой». Исследование одобрено комиссией по биоэтике ННГУ им. Н. И. Лобачевского (созданной 11.11.2016 г., приказ о создании № 497-ОД), протокол № 9 от 17.07.2017 г. Кровь разводили забуференным изотоническим раствором NaCl (ЗИР), содержащим 0,137М NaCl и 0,0027М KCl, рН 7,35 (200 г, 3 мин) в соотношении 1:1. Для выделения нейтрофильной и лимфоцитарной фракции использовали двойной градиент фиколла-урографина (ρ=1,077 г/мл, ρ=1,117 г/мл, 200 г, 40 мин). Полученные фракции раздельно отмывали ЗИР (200 г, 3 мин) и использовали в конечной концентрации 1·106 кл/мл. Клетки брали в эксперимент сразу после выделения, жизнеспособность по тесту с трипановым синим составляла не менее 99 %. Клетки инкубировали (30 мин, 37 ºС) с КТ трех видов: CdSe/ZnS-MPA (КТ-МРА), CdSe/CdZnS/ZnS-PTVР (КТ-PTVР) и CdSe/CdZnS/ZnS-APS (КТ-APS). КТ (НанотехДубна, Россия) перед экспериментами взбалтывали в перемешивающем устройстве Vortex (ELMI Ltd., Латвия) 1 мин, диспергировали в ультразвуковой ванне (РЭЛТЭК, Москва) в течение 20 мин, добиваясь однородности, после чего использовали для инкубации с клетками лейкоцитарной фракции в конечной концентрации CL50. Определение CL50 и описание основных физико-химических характеристик КТ подробно приведено в [2, 10]. После инкубации клетки переносили на поверхность предметных стекол, фиксировали глутаровым альдегидом (2,5 %, 20 мин, 24 ºС), четырежды отмывали, высушивали на воздухе (24 ºС) и сканировали в полуконтактном режиме на воздухе с помощью АСМ микроскопа NTegra (NT-MDT, Россия). Для обработки результатов сканирования использовался программный пакет Gwyddion (факультет нанометрологии Чешского метрологического института, Чехия). Использовали зонды DNP (Bruker, CША) с радиусом закругления кончика 20 нм, углом при вершине 15º, резонансной частотой около 65 кГц, константой жёсткости 0,35 Н/м. Определяли границы нормального распределения количественных показателей выборок с использованием критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения для сравнения дисперсий средних значений контроля и эксперимента использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок (параметрическая статистика), в случае ненормального распределения использовали двухвыборочный критерий Вилкоксона (непараметрическая статистика). Различия между двумя выборками считали статистически значимыми при р<0,05. Для статистического анализа использовали программу Origin Pro 8 (OriginLabCorparation, США). Результаты исследования. Для оценки степени альтерации НГ и ЛФ использовали следующие морфометрические параметры: площадь адгезии клетки, как параметр, отражающий степень развитости адгезионных контактов; площадь неадгезированной поверхности; объем клеток; среднюю высоту клеток; их максимальную высоту как критерий степени неоднородности клеточной поверхности. Кроме того, рассчитывали коэффициент адгезии, как отношение площади адгезии клетки к неадгезированной поверхности. Результаты измерений приведены в таблице. Очевидно, что в отношении НГ и ЛФ альтерирующая активность КТ проявляется неодинаково. В частности, у НГ увеличивается максимальная и средняя высота под воздействием КТ-PTVР, и только средняя высота под воздействием КТ-APS. В то же время, у ЛФ, напротив, уменьшается максимальная высота под действием КТ-МРА и КТ-APS. Средняя высота ЛФ показывает разнонаправленную реакцию в зависимости от типа КТ: под действием КТ-МРА и КТ-APS она снижается, а КТ-PTVР вызывает рост среднего значения высоты ЛФ. Для определения альтерирующего влияния КТ на фокальные адгезионные контакты клеток с поверхностью мы предлагаем использовать коэффициент адгезии, который рассчитывается как отношение площади адгезии к неадгезированной поверхности. Анализ коэффициента адгезии показывает, что в случае НГ увеличение высоты напрямую связано с потерей клеткой способности полноценно адгезироваться на поверхности, что, по всей вероятности, обусловлено прямой альтерацией КТ адгезионных рецепторов НГ. В случае ЛФ наблюдается обратная реакция: тенденция к увеличению коэффициента адгезии, что, по всей вероятности, и обуславливает снижение максимальной и средней высоты клеток. КТ вызывают незначительное снижение объема НГ (кроме КТ-APS, под влиянием которых объем падает статистически значимо), тогда как для ЛФ вновь наблюдаются разнонаправленные реакции объема клеток на разные типы КТ: под воздействием КТ-МРА - объем снижается, КТ-PTVР - увеличивается, а КТ-APS - не изменяется. Поскольку не все морфометрические критерии оказались достаточно чувствительными для оценки альтерации клеток лейкоцитарной фракции КТ были дополнительно проанализированы разные варианты клеточной гибели на основе структурно-морфологических особенностей. Результаты представлены на рис. 1 для НГ и на рис. 2 для ЛФ. В целом анализ основных вариантов клеточной гибели показывает, что и НГ, и ЛФ под действием КТ реализуют в целом сходные программы гибели, но у НГ спектр механизмов несколько шире. В частности, для НГ зафиксированы: апоптоз с формированием характерных апоптозных телец (см. рис. 1, б), быстрый нетоз (NET - neutrophil extracellular traps) (см. рис. 1, в), аутофагия, регистрируемая по характерным вакуолям разного размера (см. рис. 1, г), некроз с выраженным разрушением цитоплазматической части мембраны (см. рис. 1, д), мумификация (см. рис. 1, е). При инкубации КТ с ЛФ выявлены: некроз (см. рис. 2, б), первичный (см. рис. 2, в) и вторичный (см. рис. 2, г) апоптоз с формированием характерных апоптозных телец. Самым интересным результатом явилось обнаружение ЕТоза (ETosis - extracellular traps) у ЛФ под влиянием КТ (см. рис. 1, д, е). До этого высвобождение ядерной ДНК с образованием внеклеточных сетей лимфоцитами описано только в одном источнике [13]. Обсуждение полученных данных. Морфометрический анализ прямо указывает на то, что страдает не только структура, но и функции клеток лейкоцитарной фракции. В частности, перед трансэндотелиальной миграцией НГ после перехода в маргинальный пул подвергаются роллингу и докингу, после чего наблюдается выраженная адгезия клеток к эндотелиоцитам сосудов. Именно поэтому у НГ экспрессируются большое число рецепторов, принимающих участие в реализации одной из основных функций - адгезии. К ним относятся E-, Р-и L-селектины, ICAM- 1, VCAM-1, CD11a/CD18, CD11b/CD18, αβ2интегрины [1]. Очевидно, что в случае воздействия КТ всех трех типов на НГ наблюдается альтерация адгезионной функции, которая проявляется в уменьшении площади адгезии, коэффициента адгезии, а также увеличении средней и максимальной высоты НГ. Однако с учетом того факта, что КТ в основном не связываются, а фагоцитируются НГ [10, 11], нельзя исключить срыв фокальной адгезии НГ в результате воздействия КТ не только на трансмембранные белки (тетраспанины), но и на белки цитоскелета (талин, α-актин, тенсин, паксиллин, филамин, винкуллин) [1]. Для ЛФ, напротив, адгезионная функция основной не является, а молекулы, принимающие участие в адгезии, представлены семейством L-селектинов (CD62L, LAM-1, LECAM). Вместе с тем, для ЛФ отмечена тенденция к увеличению адгезионных контактов, которая сопровождается выраженным морфологическим сглаживанием рецепторных полей. У ЛФ, по всей вероятности, нарушаются именно мембран-ассоциированные молекулы, поскольку для ЛФ отмечена возможность только мембранного связывания КТ [10, 11]. Может наблюдаться выраженная потеря цитоплазматического содержимого клетки: у НГ объем резко уменьшается под воздействием КТ-APS, у ЛФ - под воздействием КТ-МРА. Механизм клеточной гибели не зависит от типа покрытия КТ и четко визуализируется по морфологическим признакам. В частности, для некроза отмечаются прямое разрушение клеточной мембраны и потеря клеткой цитоплазматического содержимого. В зависимости от степени выраженности некроза ядро имеет разную степень альтерации. Четко определяется апоптоз по формированию характерных апоптозных телец, а также аутофагия по образованию в цитоплазме везикул разного размера. Наиболее интересными механизмами гибели, возникающими под воздействием КТ разного состава, являются быстрый нетоз, изученный ранее у НГ под воздействием золотистого стафилококка [7] и ETоз, описанный до этого только в одной работе у ЛФ [13] под влиянием форболмеристатацетата, иономицина и в крови у больных с системной красной волчанкой. Характерной чертой этих вариантов клеточной гибели является формирование развитой внеклеточной ловушки, образованной ДНК, цитруллированными гистонами, ферментами клеток и активными формами кислорода [5]. У НГ также зафиксирован уникальный механизм клеточной гибели - мумификация, ранее обнаруженный у них под воздействием пероксида водорода и ап-конверсионных наночастиц [8, 9]. Мумифицированные клетки характеризуются грубыми выпячиваниями на поверхности, не связанными ни с гранулами, ни с вакуолями, ни с апоптозными телами. Особой чертой мумифицированных клеток является их чрезвычайно высокая ригидность. Таким образом, вне зависимости от типа покрытия КТ вызывают выраженную альтерацию как НГ, так и ЛФ, однако эта альтерация имеет разнонаправленный характер, поскольку основные морфометрические критерии клеток лейкоцитарной фракции изменяются по-разному. Для НГ отмечено нарушение фокальной адгезии, для ЛФ, напротив, наблюдалась тенденция к ее увеличению. В то же время, механизмы клеточной гибели, возникающие под действием КТ в CL50, у НГ и ЛФ практически не отличаются и могут быть легко идентифицированы по характерным морфологическим особенностям методом АСМ. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект № 16-14-10179. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. Н. П., Р. Н. К. Сбор и обработка материала: С. З. Б., О. И. Ф., Р. Н. К. Статистическая обработка данных: С. Н. П., С. З. Б., О. И. Ф., Р. Н. К. Анализ и интерпретация данных: С. Н. П., С. З. Б., О. И. Ф. Написание текста: С. Н. П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Светлана Николаевна Плескова

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского; Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева

Email: pleskova@mail.ru
Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур»; кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии» 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

Сергей Зенонович Бобык

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского; Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева

Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур»; кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии» 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

Олег Игоревич Фомичев

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского; Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева

Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур»; кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии» 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

Руслан Николаевич Крюков

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского

Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур» 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

Список литературы

Дополнительные файлы