ALTERATION OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES AND LYMPHOCYTES UNDER THE INFLUENCE OF QUANTUM DOTS (AN ATOMIC FORCE MICROSCOPIC STUDY)

Full Text

Синтез большого числа новых классов наноматериалов и увеличение их экологической нагрузки, а также попытки их внедрения в медицинскую практику с целью терапии и диагностики делают особенно актуальной проблему исследования токсичности наночастиц (НЧ) [12]. При любом механизме введения НЧ неизбежно обнаруживаются в крови, где происходит их взаимодействие как с эритроцитами, так и с клетками лейкоцитарной фракции [2]. Поскольку лимфоциты (ЛФ) связывают на своей поверхности, а нейтрофильные гранулоциты (НГ) способны напрямую фагоцитировать агрегаты НЧ [10, 11], важно знать, к каким морфологическим изменениям клеток это приводит, и какие механизмы клеточной гибели могут запускаться в результате такого взаимодействия. В настоящее время Номенклатурный комитет по клеточной гибели (Nomenclature Committee on Cell Death) официально выделяет 12 типов смерти клеток на основании морфологических, биохимических, функциональных, генетических и фармакологических особенностей [6]. Механизм клеточной гибели может напрямую влиять на развитие физиологических и ряда патологических процессов [3]. Для морфологической идентификации разных вариантов альтерации клеток и их гибели необходимо использовать современные методы высокоразрешающей микроскопии. Наибольшими преимуществами обладает атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая не требует сложной пробоподготовки и позволяет провести большое число морфометрических измерений [4]. Целью данной работы были анализ основных параметров НГ и ЛФ для оценки степени их альтерации квантовыми точками (КТ) с разным покрытием и описание основных видов клеточной гибели, развивающихся в результате такого взаимодействия. Материал и методы. Исследовали 31 образец венозной крови здоровых доноров обоих полов в возрасте 20-47 лет, полученных из «Нижегородского областного центра крови им. Н. Я. Климовой». Исследование одобрено комиссией по биоэтике ННГУ им. Н. И. Лобачевского (созданной 11.11.2016 г., приказ о создании № 497-ОД), протокол № 9 от 17.07.2017 г. Кровь разводили забуференным изотоническим раствором NaCl (ЗИР), содержащим 0,137М NaCl и 0,0027М KCl, рН 7,35 (200 г, 3 мин) в соотношении 1:1. Для выделения нейтрофильной и лимфоцитарной фракции использовали двойной градиент фиколла-урографина (ρ=1,077 г/мл, ρ=1,117 г/мл, 200 г, 40 мин). Полученные фракции раздельно отмывали ЗИР (200 г, 3 мин) и использовали в конечной концентрации 1·106 кл/мл. Клетки брали в эксперимент сразу после выделения, жизнеспособность по тесту с трипановым синим составляла не менее 99 %. Клетки инкубировали (30 мин, 37 ºС) с КТ трех видов: CdSe/ZnS-MPA (КТ-МРА), CdSe/CdZnS/ZnS-PTVР (КТ-PTVР) и CdSe/CdZnS/ZnS-APS (КТ-APS). КТ (НанотехДубна, Россия) перед экспериментами взбалтывали в перемешивающем устройстве Vortex (ELMI Ltd., Латвия) 1 мин, диспергировали в ультразвуковой ванне (РЭЛТЭК, Москва) в течение 20 мин, добиваясь однородности, после чего использовали для инкубации с клетками лейкоцитарной фракции в конечной концентрации CL50. Определение CL50 и описание основных физико-химических характеристик КТ подробно приведено в [2, 10]. После инкубации клетки переносили на поверхность предметных стекол, фиксировали глутаровым альдегидом (2,5 %, 20 мин, 24 ºС), четырежды отмывали, высушивали на воздухе (24 ºС) и сканировали в полуконтактном режиме на воздухе с помощью АСМ микроскопа NTegra (NT-MDT, Россия). Для обработки результатов сканирования использовался программный пакет Gwyddion (факультет нанометрологии Чешского метрологического института, Чехия). Использовали зонды DNP (Bruker, CША) с радиусом закругления кончика 20 нм, углом при вершине 15º, резонансной частотой около 65 кГц, константой жёсткости 0,35 Н/м. Определяли границы нормального распределения количественных показателей выборок с использованием критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения для сравнения дисперсий средних значений контроля и эксперимента использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок (параметрическая статистика), в случае ненормального распределения использовали двухвыборочный критерий Вилкоксона (непараметрическая статистика). Различия между двумя выборками считали статистически значимыми при р<0,05. Для статистического анализа использовали программу Origin Pro 8 (OriginLabCorparation, США). Результаты исследования. Для оценки степени альтерации НГ и ЛФ использовали следующие морфометрические параметры: площадь адгезии клетки, как параметр, отражающий степень развитости адгезионных контактов; площадь неадгезированной поверхности; объем клеток; среднюю высоту клеток; их максимальную высоту как критерий степени неоднородности клеточной поверхности. Кроме того, рассчитывали коэффициент адгезии, как отношение площади адгезии клетки к неадгезированной поверхности. Результаты измерений приведены в таблице. Очевидно, что в отношении НГ и ЛФ альтерирующая активность КТ проявляется неодинаково. В частности, у НГ увеличивается максимальная и средняя высота под воздействием КТ-PTVР, и только средняя высота под воздействием КТ-APS. В то же время, у ЛФ, напротив, уменьшается максимальная высота под действием КТ-МРА и КТ-APS. Средняя высота ЛФ показывает разнонаправленную реакцию в зависимости от типа КТ: под действием КТ-МРА и КТ-APS она снижается, а КТ-PTVР вызывает рост среднего значения высоты ЛФ. Для определения альтерирующего влияния КТ на фокальные адгезионные контакты клеток с поверхностью мы предлагаем использовать коэффициент адгезии, который рассчитывается как отношение площади адгезии к неадгезированной поверхности. Анализ коэффициента адгезии показывает, что в случае НГ увеличение высоты напрямую связано с потерей клеткой способности полноценно адгезироваться на поверхности, что, по всей вероятности, обусловлено прямой альтерацией КТ адгезионных рецепторов НГ. В случае ЛФ наблюдается обратная реакция: тенденция к увеличению коэффициента адгезии, что, по всей вероятности, и обуславливает снижение максимальной и средней высоты клеток. КТ вызывают незначительное снижение объема НГ (кроме КТ-APS, под влиянием которых объем падает статистически значимо), тогда как для ЛФ вновь наблюдаются разнонаправленные реакции объема клеток на разные типы КТ: под воздействием КТ-МРА - объем снижается, КТ-PTVР - увеличивается, а КТ-APS - не изменяется. Поскольку не все морфометрические критерии оказались достаточно чувствительными для оценки альтерации клеток лейкоцитарной фракции КТ были дополнительно проанализированы разные варианты клеточной гибели на основе структурно-морфологических особенностей. Результаты представлены на рис. 1 для НГ и на рис. 2 для ЛФ. В целом анализ основных вариантов клеточной гибели показывает, что и НГ, и ЛФ под действием КТ реализуют в целом сходные программы гибели, но у НГ спектр механизмов несколько шире. В частности, для НГ зафиксированы: апоптоз с формированием характерных апоптозных телец (см. рис. 1, б), быстрый нетоз (NET - neutrophil extracellular traps) (см. рис. 1, в), аутофагия, регистрируемая по характерным вакуолям разного размера (см. рис. 1, г), некроз с выраженным разрушением цитоплазматической части мембраны (см. рис. 1, д), мумификация (см. рис. 1, е). При инкубации КТ с ЛФ выявлены: некроз (см. рис. 2, б), первичный (см. рис. 2, в) и вторичный (см. рис. 2, г) апоптоз с формированием характерных апоптозных телец. Самым интересным результатом явилось обнаружение ЕТоза (ETosis - extracellular traps) у ЛФ под влиянием КТ (см. рис. 1, д, е). До этого высвобождение ядерной ДНК с образованием внеклеточных сетей лимфоцитами описано только в одном источнике [13]. Обсуждение полученных данных. Морфометрический анализ прямо указывает на то, что страдает не только структура, но и функции клеток лейкоцитарной фракции. В частности, перед трансэндотелиальной миграцией НГ после перехода в маргинальный пул подвергаются роллингу и докингу, после чего наблюдается выраженная адгезия клеток к эндотелиоцитам сосудов. Именно поэтому у НГ экспрессируются большое число рецепторов, принимающих участие в реализации одной из основных функций - адгезии. К ним относятся E-, Р-и L-селектины, ICAM- 1, VCAM-1, CD11a/CD18, CD11b/CD18, αβ2интегрины [1]. Очевидно, что в случае воздействия КТ всех трех типов на НГ наблюдается альтерация адгезионной функции, которая проявляется в уменьшении площади адгезии, коэффициента адгезии, а также увеличении средней и максимальной высоты НГ. Однако с учетом того факта, что КТ в основном не связываются, а фагоцитируются НГ [10, 11], нельзя исключить срыв фокальной адгезии НГ в результате воздействия КТ не только на трансмембранные белки (тетраспанины), но и на белки цитоскелета (талин, α-актин, тенсин, паксиллин, филамин, винкуллин) [1]. Для ЛФ, напротив, адгезионная функция основной не является, а молекулы, принимающие участие в адгезии, представлены семейством L-селектинов (CD62L, LAM-1, LECAM). Вместе с тем, для ЛФ отмечена тенденция к увеличению адгезионных контактов, которая сопровождается выраженным морфологическим сглаживанием рецепторных полей. У ЛФ, по всей вероятности, нарушаются именно мембран-ассоциированные молекулы, поскольку для ЛФ отмечена возможность только мембранного связывания КТ [10, 11]. Может наблюдаться выраженная потеря цитоплазматического содержимого клетки: у НГ объем резко уменьшается под воздействием КТ-APS, у ЛФ - под воздействием КТ-МРА. Механизм клеточной гибели не зависит от типа покрытия КТ и четко визуализируется по морфологическим признакам. В частности, для некроза отмечаются прямое разрушение клеточной мембраны и потеря клеткой цитоплазматического содержимого. В зависимости от степени выраженности некроза ядро имеет разную степень альтерации. Четко определяется апоптоз по формированию характерных апоптозных телец, а также аутофагия по образованию в цитоплазме везикул разного размера. Наиболее интересными механизмами гибели, возникающими под воздействием КТ разного состава, являются быстрый нетоз, изученный ранее у НГ под воздействием золотистого стафилококка [7] и ETоз, описанный до этого только в одной работе у ЛФ [13] под влиянием форболмеристатацетата, иономицина и в крови у больных с системной красной волчанкой. Характерной чертой этих вариантов клеточной гибели является формирование развитой внеклеточной ловушки, образованной ДНК, цитруллированными гистонами, ферментами клеток и активными формами кислорода [5]. У НГ также зафиксирован уникальный механизм клеточной гибели - мумификация, ранее обнаруженный у них под воздействием пероксида водорода и ап-конверсионных наночастиц [8, 9]. Мумифицированные клетки характеризуются грубыми выпячиваниями на поверхности, не связанными ни с гранулами, ни с вакуолями, ни с апоптозными телами. Особой чертой мумифицированных клеток является их чрезвычайно высокая ригидность. Таким образом, вне зависимости от типа покрытия КТ вызывают выраженную альтерацию как НГ, так и ЛФ, однако эта альтерация имеет разнонаправленный характер, поскольку основные морфометрические критерии клеток лейкоцитарной фракции изменяются по-разному. Для НГ отмечено нарушение фокальной адгезии, для ЛФ, напротив, наблюдалась тенденция к ее увеличению. В то же время, механизмы клеточной гибели, возникающие под действием КТ в CL50, у НГ и ЛФ практически не отличаются и могут быть легко идентифицированы по характерным морфологическим особенностям методом АСМ. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект № 16-14-10179. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. Н. П., Р. Н. К. Сбор и обработка материала: С. З. Б., О. И. Ф., Р. Н. К. Статистическая обработка данных: С. Н. П., С. З. Б., О. И. Ф., Р. Н. К. Анализ и интерпретация данных: С. Н. П., С. З. Б., О. И. Ф. Написание текста: С. Н. П. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

S. N. Pleskova

N. I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod; R. E. Alekseev Nizhny Novgorod State Technical University

Email: pleskova@mail.ru
Research and Education Center «Physics of Solid State Nanostructures»; Department of Nanotechnology and Biotechnology 23 Gagarina av., Nizhny Novgorod 3603950

S. Z. Bobyk

N. I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod; R. E. Alekseev Nizhny Novgorod State Technical University

Research and Education Center «Physics of Solid State Nanostructures»; Department of Nanotechnology and Biotechnology 23 Gagarina av., Nizhny Novgorod 3603950

O. I. Fomichev

N. I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod; R. E. Alekseev Nizhny Novgorod State Technical University

Research and Education Center «Physics of Solid State Nanostructures»; Department of Nanotechnology and Biotechnology 23 Gagarina av., Nizhny Novgorod 3603950

R. N. Kryukov

N. I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod

Research and Education Center «Physics of Solid State Nanostructures» 23 Gagarina av., Nizhny Novgorod 3603950

References

Supplementary files