Гистохимическое выявление тучных клеток в мягкой мозговой оболочке крысы

Полный текст

Тучные клетки (мастоциты) – это клетки гематопоэтического происхождения, основная функция которых защищать органы и ткани от патогенов и аллергенов. Помимо этого, доказано участие мастоцитов в регуляции гемодинамики и проницаемости кровеносных сосудов, ангиогенеза, нейрогенеза во взрослом мозге и тканевого гомеостаза [1]. Показана причастность тучных клеток к патогенезу ряда аутоиммунных, сердечно-сосудистых, онкологических, нервных и психических заболеваний [2]. Многофункциональность тучных клеток обеспечивается огромным количеством их медиаторов и рецепторов, которые дают им возможность взаимодействовать с окружающими клетками и элементами эндокринной и иммунной систем организма.

Мастоциты были обнаружены практически во всех органах млекопитающих. У некоторых из них они были описаны в мягкой мозговой оболочке [3]. Мягкая мозговая оболочка (pia mater) – самая глубокая из мозговых оболочек, которая прилегает к внешнему слою нервной ткани, повторяя контуры борозд и извилин мозга. Она состоит из коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон, слоя лептоменингеальных клеток, пронизана многочисленными кровеносными сосудами и формирует своего рода обшивку вокруг сосудов, которые входят и выходят из головного мозга [4].

Для выявления тучных клеток чаще всего используют классический метод окраски анилиновыми красителями, которыми мастоциты окрашиваются метахроматически, то есть отлично от цвета остальных элементов ткани. Однако мастоциты гетерогенны по своим морфологическим и химическим свойствам [2], в результате чего разные красители с разной эффективностью выявляют их в разных органах [5, 6]. В случае изучения тучных клеток человека часто используются высокоэффективные методы иммуногистохимии, которые позволяют выявлять протеазы тучных клеток, однако данные методы и антитела не подходят для использования на крысе, поскольку у неё другой набор протеаз, а высокоэффективные антитела к этим белкам не получены к настоящему времени. Вследствие этого гистохимический метод выявления тучных клеток является методом выбора в работах на крысах, но возникает необходимость подбора наиболее эффективного метода визуализации мастоцитов в каждом отдельном органе. В настоящей работе мы провели тестирование трёх различных красителей для нахождения оптимального способа гистохимического окрашивания тучных клеток в мягкой мозговой оболочке крысы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа проведена на 15 крысах линии Вистар в возрасте 5, 14 и 30 дней. При содержании и умерщвлении животных руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.), Хельсинкской декларацией 1975 г. и её пересмотренным вариантом 2000 г. План проведения работ утверждён и одобрен на заседании Локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 3/19 от 25.04.2019). Фиксацию головного мозга проводили в цинк-этанол-формальдегиде в течение 1 сут. Затем материал обезвоживали, заливали в парафин обычным способом. Использовали серийные срезы мозга толщиной 6–7 мкм. Для гистохимического выявления тучных клеток препараты окрашивали одним из следующих красителей: крезиловым фиолетовым (Merck, Германия), метиленовым зелёным (Ferak Berlin, Германия), толуидиновым синим (Acros organics, Бельгия) по методу Ниссля, используя во всех случаях 0,1% водные растворы красителей. Препараты депарафинизировали и регидратировали обычным способом через ксилолы и спирты, доводили их до дистиллированной воды, а затем производили окраску 10–12 мин в заранее приготовленных растворах красителей. Дифференцировали в 96-градусном спирте, проводили через две порции изопропилового спирта, просветляли в ксилолах и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Полученные препараты анализировали с помощью светового микроскопа Leica DM750 (Германия) и фотографировали с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интенсивность окрашивания срезов мозга каждым из красителей не зависела от возраста крыс. Тучные клетки были обнаружены в мягкой мозговой оболочке крыс всех исследованных возрастов, но с разной частотой. Они выделялись метахроматической фиолетовой окраской среди других ортохроматически окрашенных (сине-голубых) клеток (см. рис.) и представляли собой крупные округлые и продолговатые гранулярные клетки с размером длиной оси до 8–10 μм. Мастоциты можно было выявить на препаратах, окрашенных любым из использованных красителей. На препаратах, где были использованы крезиловый фиолетовый или толуидиновый синий, интенсивно окрашивались все клеточные элементы нервной ткани, однако на этом фоне слабо выделялись метахроматически окрашенные тучные клетки. После окрашивания метиленовым зелёным окраска срезов мозга была более бледной (светлого сине-зелёного цвета), но метахроматически ярко окрашенные тёмно-синие тучные клетки на этом фоне контрастно выделялись и были видны очень отчётливо.

 

Рис. Тучные клетки в мягкой оболочке мозга крысы в возрасте 14 сут. Препараты окрашены метиленовым зелёным (a, b), толуидиновым синим (c, d) или крезиловым фиолетовым (e, f). Тучные клетки обозначены стрелками. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×40 (a, c, e), ×100 (b, d, f).

Fig. Mast cells in the pia mater of 14 day-old rat. Specimens are stained with methylene green (a, b), toluidine blue (c, d), and cresyl violet (e, f). Mast cells are indicated by arrows. Magnification: ocular ×10, lens ×40 (a, c, e), ×100 (b, d, f).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление тучных клеток с помощью гистохимического метода метахроматического окрашивания широко используется как наиболее доступный и достаточно эффективный способ визуализации мастоцитов. Однако визуализация мастоцитов в большой мере зависит от избранного красителя и фиксатора, от типа тучных клеток и исследуемой ткани, от вида животного. В результате такой многофакторной вариабельности данный метод применительно к нервной ткани не всегда позволяет получить хорошие результаты. Так, например, мастоциты долгое время вообще не удавалось обнаружить в мозге человека или их обнаруживали только в части препаратов [5, 7]. Данные о присутствии тучных клеток в структурах мозга крыс характеризуются противоречивостью, что связано с отсутствием унифицированного и эффективного метода их выявления, который бы позволял однозначно оценивать наличие и морфологические особенности мастоцитов. Поэтому отработка оптимальной методики для адекватного изучения тучных клеток в конкретной структуре имеет большое значение.

Нами исследовались срезы мозга растущих крыс, окрашенные крезиловым фиолетовым, толуидиновым синим и метиленовым зелёным с целью выявления тучных клеток в мягкой мозговой оболочке. Все 3 красителя позволили визуализировать тучные клетки наряду с другими клеточными элементами мягкой мозговой оболочки (как и единичные тучные клетки в собственно нервной ткани). Крезиловый фиолетовый и толуидиновый синий интенсивно окрашивали все клеточные элементы нервной ткани, что обеспечивало высокое качество препаратов для изучения поверхностных и глубоких структур мозга, однако на фоне этой интенсивной окраски метахроматически окрашенные тучные клетки визуализировались плохо, иногда их было невозможно отдифференцировать от окружающей ткани. В отличие от указанных двух красителей метиленовый зелёный давал более слабую окраску срезов мозга, на её фоне тучные клетки окрашивались ярко и их метахромазия чётко регистрировалась при цифровой фотосъёмке.

ВЫВОДЫ

Результаты проведённого исследования показывают, что для изучения мастоцитов в мягкой мозговой оболочке крыс оптимально подходит метахроматическая окраска метиленовым зелёным. Она позволяет легко выявлять пиальные мастоциты, исследовать их морфологические особенности, взаиморасположение с соседними структурными элементами и удобна для морфометрического исследования тучных клеток.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Коржевский Д.Э. – концепция и дизайн исследования; Коржевский Д.Э., Фёдорова Е.А., Суфиева Д.А. – сбор и обработка материала; Коржевский Д.Э., Григорьев И.П. – анализ и интерпретация данных, написание текста; Суфиева Д.А. – оформление микрофотографий.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions. D.E. Korzhevskii created the study concept and design; D.E. Korzhevskii, E.A. Fedorova, and D.A. Sufieva collected and processed the material; D.E. Korzhevskii, I.P. Grigoriev performed the data analysis and interpretation, and wrote the text; D.A. Sufieva drew up the microphotographs.

Об авторах

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: dek2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029

д.м.н., профессор

Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Елена Анатольевна Фёдорова

Институт экспериментальной медицины

Email: el-fedorova2014@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0190-885X
SPIN-код: 5414-4122

научный сотрудник, к.б.н.

Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дина Азатовна Суфиева

Институт экспериментальной медицины

Email: dinobrione@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0048-2981
SPIN-код: 3034-3137

научный сотрудник

Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Игорь Павлович Григорьев

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: ipg-iem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3535-7638
SPIN-код: 1306-4860

старший научный сотрудник, к.б.н.

Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы