Иммунофенотипическая характеристика экспрессии индуцибельной NO-синтазы в зубчатой извилине крыс зрелого возраста при моделировании депрессии и её фармакологической коррекции

Полный текст

Депрессия привлекает всё больше внимания, поскольку не только усложняет прогноз многих хронических заболеваний, но и рассматривается в качестве одной из наиболее распространённых причин снижения трудоспособности населения [1, 2]. Формирование депрессивного состояния [3] наблюдается при смешанных тревожно-депрессивных расстройствах, деменциях различного генеза, болезни Паркинсона, эпилепсии, соматической патологии, реакциях на тяжёлый стресс, расстройствах адаптации, старении [2]. Наряду с генетическими факторами (около 40%) внешние факторы окружающей среды, такие как, например, стрессовые события, считаются вовлечёнными в начало депрессии [1]. Стрессовые события в свою очередь могут вызывать ряд психологических и физиологических изменений, включая активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и симпатической нервной системы, которые можно назвать реакциями на психологический стресс [2].

Хронический стресс вызывает снижение экспрессии нейротрофических факторов в головном мозге, ингибирует нейрогенез и ведет к уменьшению общего количества нейронов в зубчатой извилине [2, 4]. Снижение уровня нейрогенеза в зубчатой извилине может оказывать влияние на уменьшение объёма гиппокампа, которое наблюдается у пациентов с большим депрессивным расстройством, что в свою очередь приводит к снижению гиппокампзависимых функций головного мозга [5].

Доклинические исследования продемонстрировали, что вызванное стрессом и глюкокортикоидами подавление нейрогенеза в зубчатой извилине может быть предотвращено или отменено антидепрессантами, которые также обладают прямыми нейрогенными эффектами [5, 6]. Кроме того, было показано, что сигнальный путь синтеза оксида азота (NO) играет решающую роль в нейробиологии стресса и депрессии [7, 8]. NO синтезируется из L-аргинина посредством фермента NO-синтазы (NOS). Существует 3 изоформы NOS: нейрональная NOS (nNOS), индуцибельная NOS (iNOS) и эндотелиальная NOS (eNOS). Ингибиторы NOS, например L-NAME (неспецифический ингибитор NOS), аминогуанидин (специфический ингибитор iNOS), 7-нитроиндазол (специфический ингибитор nNOS) оказывают антидепрессивное и анксиолитическое действие, некоторые антидепрессанты, такие как пароксетин, ингибируют активность NOS [8]. Таким образом, исследование морфофункциональных изменений в ЦНС при депрессии и её фармакологической коррекции, препаратами, модулирующими пути синтеза NO, может способствовать формированию новых терапевтических стратегий лечения депрессии.

Целью исследования явилось выявить особенности экспрессии индуцибельной NO-синтазы в зубчатой извилине у крыс зрелого возраста при моделировании депрессии, а также установить возможность фармакологической коррекции выявленных изменений фенибутом и соединениями под лабораторными шифрами РГПУ-189, РГПУ-135.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 50 нелинейных белых крысах-самцах в возрасте 12 мес (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»» РАМН, Ленинградская область) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларации (1975, 2000 г.). Депрессивноподобное поведение у животных моделировали путём сочетания таких видов стрессового воздействия, как громкий звук, пульсирующий яркий свет, вибрация, которые действовали на фоне постоянного ограничения подвижности и колебания температуры среды в течение 7 дней (ежедневно по 30 мин). Стрессоры были непредсказуемыми для животных, а моделирование депрессии у животных осуществлялось в специальной камере, содержащей 6 изолированных отсеков. При использовании данной модели у животных наблюдались симптомы депрессивноподобного поведения, имеющие выраженное феноменологическое сходство с клинической картиной депрессии: тревожность, поведенческие корреляты отчаяния, гиподинамия, ангедония, аналогичные описанным ранее [9].

Животные были разделены на 5 групп:

• 1-я группа (n=10) – контрольные крысы,
• 2-я группа (n=10) – крысы с экспериментальной депрессией,
• 3-я группа (n=10) – крысы с экспериментальной депрессией, получавшие фенибут,
• 4-я группа – крысы с экспериментальной депрессией, получавшие соединение с лабораторным шифром РГПУ-189 (салифен – производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), композиция фенибута с салициловой кислотой),
• 5-я группа – крысы с экспериментальной депрессией, получавшие соединение с лабораторным шифром РГПУ-135 (нейроглутам – β-фенильное производное глутаминовой кислоты).

Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования депрессивного состояния в следующих дозах: фенибут 25 мг/кг, РГПУ-189 30 мг/кг, РГПУ-135 26 мг/кг. 1-я и 2-я группы животных получали соответственно массе эквивалентный объём физиологического раствора. Эвтаназию животных проводили с использованием «Гильотины для крыс» (AE0702, производитель «Open Science», Россия). Головной мозг фиксировали в нейтральном забуференном 10% формалине. Для иммуногистохимического исследования во фронтальной плоскости изготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, которые изучали на уровне от -2,40 до -3,96 мм относительно брегмы [10]. Для иммуногистохимического исследования использовали первичные поликлональные кроличьи антитела против iNOS (разведение 1:100; GeneTex, Inc., США). Для визуализации применяли полимерную систему N-Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences, Inc., Япония). В качестве хромогена использовали субстратную систему N-Histofine DAB-3S kit (Nichirei Biosciences, Inc., Япония). Оценку изменений уровня экспрессии iNOS в зубчатой извилине определяли путём подсчёта относительной площади иммунореактивного материала (ИРМ) с использованием модуля Image Analysis программы ZEN 1.1.2.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия), а также интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 – иммунонегативная реакция; 1 – слабо выраженное окрашивание; 2 – умеренно выраженное окрашивание; 3 – максимально выраженное окрашивание). Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа «Axio Lab. A1» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия), фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Обобщённые данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала (Q1-Q3), где Q1 – 25 процентиль, Q3 – 75 процентиль. Различия между группами оценивали по критерию Краскела-Уоллиса с последующим множественным сравнением групп между собой с использованием критерия Дана и считали статистически значимыми при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При оценке результатов иммуногистохимического исследования в гранулярном слое зубчатой извилины у крыс с экспериментальной депрессией, по сравнению с контрольной группой животных, в цитоплазме перикарионов нейронов отмечалось увеличение степени экспрессии iNOS-ИРМ до умеренно-выраженной (2 балла, см. рис.).

 

Рис. Патоморфологические изменения в зубчатой извилине крыс при экспериментальной депрессии: a – 1-я группа, контроль. b – 2-я группа, депрессия. c – 3-я группа, депрессия+фенибут. d – 4-я группа, депрессия+РГПУ-189. e – 5-я группа, депрессия+РГПУ-135. Иммуногистохимическое исследование с использованием первичных антител против iNOS. Ув. ×400.

 

При этом в единичных нейронах наблюдалась выраженная степень цитоплазматической экспрессии iNOS-ИРМ, в том числе на границе гранулярного и субгранулярного слоёв. В нейропиле субгранулярного слоя, а также в цитоплазме нервных клеток зубчатой извилины как у животных контрольной группы, так и у животных с экспериментальной депрессией преобладала умеренновыраженная экспрессия iNOS-ИРМ (2 балла). В молекулярном слое зубчатой извилины у крыс с экспериментальной депрессией встречались нейроны с умеренновыраженной цитоплазматической экспрессией (2 балла), нейропиль, как и у контрольной группы животных, характеризовался слабовыраженной экспрессией iNOS-ИРМ (1 балл). При оценке результатов морфометрического исследования наблюдалось увеличение относительной площади iNOS-ИРМ в зубчатой извилине у крыс с депрессией на 8,5% (p <0,05), по сравнению с контролем (см. табл.).

 

Таблица. Изменение относительной площади iNOS-ИРМ в зубчатой извилине крыс зрелого возраста при фармакологической коррекции, депрессии, Me (Q₁-Q₂), %

Table. Change in the relative area of iNOS-IRM in the dentate gyrus of mature rats during pharmacological correction, depression, Me (Q₁-Q₂), %

Контроль	Депрессия	Депрессия+фенибут	Депрессия+РГПУ-189	Депрессия+РГПУ-135
8,2 (7,1–9,9)	16,7* (10,5–22,1)	16,0* (14,2–20,1)	8,0# (7,2–8,9)	12,2 (3,1–20,6)

Примечания. Различия достоверны при p <0,05: * по сравнению с животными группы контроль, # по сравнению с животными группы депрессия (критерий Краскела-Уоллиса с посттестом Дана).

 

При фармакологической коррекции экспериментальной депрессии у крыс фенибутом и соединениями с лабораторными шифрами РГПУ-189, РГПУ-135 в зубчатой извилине при иммуногистохимическом окрашивании с применением антител к iNOS отмечалось преобладание морфологических признаков обратимых изменений в нейронах. В цитоплазме перикарионов нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины крыс при применении фенибута и РГПУ-135, как и у животных с экспериментальной депрессией, отмечалась умеренная экспрессия iNOS-ИРМ (2 балла), которая носила гранулярный характер. Напротив, применение соединения РГПУ-189 продемонстрировало у животных слабовыраженную экспрессию iNOS-ИРМ (1 балл) в цитоплазме перикарионов нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины, что соответствует экспрессии в контрольной группе животных (см. рис.). На границе гранулярного и субгранулярного слоёв при фармакологической коррекции фенибутом и соединением с лабораторным шифром РГПУ-135 в соответствующих группах животных встречались нейроны с выраженной цитоплазматической экспрессией (3 балла), а при коррекции соединением РГПУ-189 – с умеренно-выраженной цитоплазматической экспрессией (2 балла). У групп животных с экспериментальной депрессией, получавших исследуемые соединения и фенибут, в нейропиле и нервных клетках субгранулярного слоя зубчатой извилины наблюдался схожий с контрольной группой животных характер экспрессии iNOS-ИРМ: умеренная гранулярная экспрессия в нейропиле (2 балла), отсутствие экспрессии в нервных клетках (0 баллов), либо наличие умеренно-выраженной экспрессии в единичных нервных клетках (2 балла). Экспрессия iNOS-ИРМ в молекулярном слое зубчатой извилины у групп животных, получавших фармакокоррекцию, соответствовала экспрессии наблюдаемой у животных контрольной группы и группы с экспериментальной депрессией. Морфометрическая оценка относительной площади iNOS-ИРМ в зубчатой извилине у животных с фармакокоррекцией продемонстрировала достоверное снижение данного параметра, по сравнению с животными с экспериментальной депрессией, только в группе животных, получавших соединение с лабораторным шифром РГПУ-189, наблюдалось уменьшение относительной площади iNOS-ИРМ на 8,7% (p<0,05) (см. табл.).

ОБСУЖДЕНИЕ

При моделировании депрессии индуцированной действием комбинированного стресса у крыс зрелого возраста в зубчатой извилине нами было обнаружено увеличение степени экспрессии и относительной площади iNOS-ИРМ в цитоплазме перикарионов нейронов, что может быть вызвано гиперактивацией пути L-аргинин/NOS/NO, с последующим увеличением выработки NO и его метаболитов, обеспечивающих активацию процессов нейровоспаления, что является основной причиной нейродегенеративных, психических и поведенческих расстройств в экспериментальных исследованиях на животных [8, 11]. Так, острый иммобилизационный стресс в течение 6 ч вызывал повышенную экспрессию iNOS в коре головного мозга, которая опосредуется через N-метил-D-аспартатные (NMDA) рецепторы с последующей активацией транскрипционного фактора NF-κB [12]. Данный факт также подтверждается в исследовании Shirakawa et al. [13], где вызванное острым стрессом увеличение метаболитов NO было связано с глутаматергической активацией нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса. В другом исследовании депрессивноподобное поведение у животных, вызванное хроническим непредсказуемым мягким стрессом, приводило к повышению уровня нитритов в плазме крови и экспрессии мРНК iNOS в коре головного мозга. Эти эффекты могут быть ослаблены или предотвращены с помощью ингибиторов NOS, что было продемонстрировано внутригиппокампальной инъекцией селективного ингибитора iNOS, аминогуанидина и приводило к подавлению депрессивного поведения у крыс [12]. Фармакологическая коррекция салифеном (производное ГАМК, РГПУ-189) при моделировании перинатальной гипоксии приводила к увеличению количества глюкокортикоидных рецепторов в дорсальном отделе гиппокампа, но не в зубчатой извилине у новорождённых крысят [14]. Обнаруженное в нашем исследовании значимое увеличение уровня iNOS-ИРМ в зубчатой извилине крыс зрелого возраста при моделировании депрессии, а также снижение данного параметра при фармакологической коррекции РГПУ-189 (салифеном) и РГПУ-135 (нейроглутамом) может свидетельствовать о преобладающем нейропротективном влиянии соединения РГПУ-189, индуцирующего ГАМК-ергическую нейротрансмиссию с участием ГАМК-опосредованных рецепторных механизмов, также лежащих в основе регуляции нейрогенеза в зубчатой извилине у взрослых [5]. Снижение относительной площади экспрессии iNOS-ИРМ в зубчатой извилине крыс при фармакологической коррекции депрессивного состояния РГПУ-135 (нейроглутамом) не характеризовалось достоверными отличиями от группы депрессии что, вероятно, свидетельствует о меньшем вкладе РГПУ-135 в процессы модуляции глутаматергической нейротрансмиссии [14] с возможным вовлечением различных видов глутаматных рецепторов [9].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при экспериментальном моделировании депрессии у крыс зрелого возраста в зубчатой извилине обнаружено увеличение уровня экспрессии iNOS-иммунореактивного материала, что рассматривается как признак увеличения выработки NO и его метаболитов, способствующих реализации процессов повреждения нейронов и активации нейровоспаления. Снижение уровня экспрессии iNOS-иммунореактивного материала в зубчатой извилине крыс зрелого возраста при фармакологической коррекции депрессивного состояния РГПУ-189 (салифеном) может свидетельствовать о преобладающем нейропротективном влиянии данного соединения на ГАМК-ергические механизмы нейротрансмиссии.

Необходимо дальнейшее изучение роли индуцибельной NO-синтазы и NO в процессах модуляции глутаматергической и ГАМК-ергической нейротрансмиссии в зубчатой извилине при депрессии и под влиянием фармакологической коррекции.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Волгоградской области в рамках научного проекта № 19-415-340004\19.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования – И.Н. Тюренков, А.В. Смирнов; сбор и обработка материала – М.Р. Экова., Е.В. Волотова; статистическая обработка данных – М.Р. Экова; анализ и интерпретация данных – А.В. Смирнов, И.Н. Тюренков, М.Р. Экова; написание и редактирование текста – М.Р. Экова, А.В. Смирнов, И.Н. Тюренков.

Funding. The study was supported by of the Russian Foundation for Basic Research and the Administration of the Volgograd Region within the scientific project No. 19-415-340004\19.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions. I.N. Tyurenkov, A.V. Smirnov – created the study concept and design; M.R. Ekova., E.V. Volotova – collected and processed the material; M.R. Ekova – performed the statistical data processing; A.V. Smirnov, I.N. Tyurenkov, and M.R. Ekova – performed the data analysis and interpretation; M.R. Ekova, A.V. Smirnov, and I.N. Tyurenkov – wrote and edited the text.

Об авторах

Алексей Владимирович Смирнов

Волгоградский медицинский научный центр

Email: alexey-smirnov@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105
SPIN-код: 8931-7823

д.м.н., проф.

Россия, Волгоград

Мария Рафаэлевна Экова

Волгоградский медицинский научный центр

Автор, ответственный за переписку.
Email: maria.ekova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8655-1441
SPIN-код: 8345-5503

к.м.н.

Россия, Волгоград

Иван Николаевич Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: fibfuv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7574-3923
SPIN-код: 6195-6378

д.м.н., проф. член-корр. РАН

Россия, Волгоград

Елена Владимировна Волотова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: evv.md@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3916-7249
SPIN-код: 1483-0915

д.м.н.

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы