ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЗАДНЕМЕДИАЛЬНОГО, ЗАДНЕЛАТЕРАЛЬНОГО ВЕНТРАЛЬНЫХ И РЕТИКУЛЯРНОГО ЯДЕР ТАЛАМУСА КРЫС (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Полный текст

Ранее нами была показана неоднородность распределения нейрональных и глиальных элементов на уровне IV слоя колонок соматической коры мозга крысы, где расположены баррели - третье корковое представительство вибрисс [1]. Между тем, таламус и его проекции на кору имеют определяющее значение для формирования зоны вибрисс в мозгу млекопитающих и играют ключевую роль в процессах обработки сенсорной, в том числе, тактильной информации и формировании поведенческих реакций [9]. Заднемедиальное вентральное ядро (VPMN) таламуса, подобно IV слою неокортекса, характеризуется наличием цитоархитектонических групп нейронов - «баррелоидов». Эти структуры являются подкорковым (2-м) уровнем представительства вибрисс и центром передачи информации от главного сенсорного ядра тройничного нерва в соматосенсорную кору [2]. В то время, как специфические ядра заднелатеральное (VPLN) и VPMN связаны с проведением соматосенсорной информации, коллатерали нейронов неспецифического ретикулярного ядра таламуса (RTN) являются единственным внешним источником торможения для всех ядер таламуса, в том числе для VPMN и VPLN [8]. Морфологические особенности этих ядер, в том числе зоны баррелоидов, малоизучены, кроме того, сравнительное морфологическое исследование коркового и таламического представительства вибрисс не проводилось. Цель данной работы - исследование экспрессии нейрональных и глиальных белков, а также белков щелевых контактов в VPMN, VPLN и RТN. Материал и методы. Исследование проведено на 7 крысах обоего пола массой 150-200 г. Содержание животных и экспериментальные исследования осуществляли в соответствии с протоколом, утвержденным Комиссией по биоэтике Южного федерального университета 18 апреля 2012 г. Животным вводили нембутал в дозе 60 мг/кг и проводили транскардиальную перфузию 10% забуференным формалином через систему Perfusion Two (Leica, Германия). После дополнительной фиксации головного мозга фомалином в течение 24 ч из него выделяли участок по координатам: первый разрез - 0,2 мм рострально от брегмы, второй разрез - 6,04 мм каудально от брегмы, при этом латерально мозг не рассекали. Иссеченный фрагмент прикрепляли каудальной стороной среза вниз, на вибратоме VT 1000E (Leica, Германия) на холоду изготавливали фронтальные срезы толщиной 100 мкм до тех пор, пока под стереотаксической лупой не обнаруживали на них исследуемые ядра таламуса (рис. 1, а). В отличие от баррелей коры мозга выявление баррелоидов на вибратомных срезах должно происходить с учетом необходимости подбора оптимального угла изготовления срезов. В проведенных ранее исследованиях мозга взрослых крыс было показано, что для наилучшего выявления баррелоидов необходимо устанавливать наклонные по отношению к горизонтальной поверхности углы резки [7]. Существуют несколько вариантов изготовления срезов: под углом 40º против часовой стрелки - для обнаружения отдельных дуг баррелоидов, под углом 30º по часовой стрелке - для выявления отдельных рядов баррелоидов [5]. В настоящей работе четкое баррелоидное поле VPMN таламуса на вибратомных срезах нам удалось выявить при отклонении режущего лезвия от горизонтальной плоскости на 45º во время резки. После обнаружения баррелоидов головной мозг заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохимическое исследование ядер таламуса проводили на парафиновых срезах толщиной 4 мкм. Использовали систему визуализации Dako EnVision System+Peroxidase (DAB) (Dako, Дания) и первичные мышиные моно-и кроличьи поликлональные антитела: 1) Neurofilament, клон F11, 1:100, мышиные (Dako, Дания) для выявления элементов цитоскелета нейронов - белков нейрофиламентов (NF); 2) Polyclonal Myelin Basic Protein, кроличьи (Dako, Дания) для выявления основного белка миелина (MBP); 3) для выявления астроцитов - глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), клон 6F2, 2:100, мышиные (Dako, Дания); 4) Synaptophysin (Syn), клон SY38, 5:100, мышиные (Dako, Дания) для выявления белка синаптических везикул синаптофизина; 5) Anti-Parvalbumin, клон PARV-19, 1:2000, мышиные (Sigma-Aldrich, США) для выявления кальций-связывающего белка тормозных нейронов - парвальбумина (PA); 6) Polyclonal Anti-Somatostatin Receptor Type2, 1:200, кроличьи (Sigma-Aldrich, США) для выявления гормон-подавляющего нейропептида; 7) Polyclonal Anti-Connexin 36, 1:50, кроличьи (Invitrogen, США) для выявления белка щелевых контактов нейронов; 8) Polyclonal Anti-Connexin 43, 1:100, кроличьи (Spring Bioscience, США) для выявления щелевых контактов астроцитов. В каждом случае проводили отрицательный контроль - вместо первичных антител на срезы наносили промывочный буфер - En Vision Flex Wash Buffer (Дако, Дания). После проведения иммуногистохимической реакции ядра нейронов докрашивали гематоксилином. Светооптическое исследование проводили при помощи микроскопа DM 2500 (Leica, Германия) со встроенной камерой DFC 495 (Leica, Германия). Результаты исследования. На фронтальных неокрашенных вибратомных срезах толщиной 100 мкм, изготовленных под углом 45º, баррелоиды выявляются на уровне VPMN в виде компактных ячеистых структур, расположенных в несколько рядов (см. рис. 1, а). Стенки (септы) баррелоидов - темнее по сравнению с оптически светлой центральной частью за счет более высокой плотности расположения нейронов и их отростков именно в стенках баррелоидов. В этой связи ячеистая структура баррелоидного поля выявляется за счет толщины вибратомных срезов и, как правило, не определяется на тонких срезах толщиной 4 мкм при стандартных морфологических окрасках. При иммуногистохимическом исследовании на парафиновых срезах экспрессии MBP и NF обнаружено, что миелиновые и безмиелиновые волокна в VPMN и VPLN имеют горизонтально ориентированное параллельное расположение и формируют крупные пучки, которые в VPMN расположены между баррелоидами. Наибольшая интенсивность экспрессии MBP и NF обнаружена в RTN. Чередование пучков миелиновых и безмиелиновых нервных волокон обеспечивает этой структуре характерное сетчатое строение (см. рис. 1, в, г). Таким образом, экспрессия MBP позволяет определить границы VPMN, VPLN и RTN на тонких срезах толщиной 4 мкм. В исследуемых ядрах таламуса отмечена умеренная равномерная экспрессия синаптофизина (Syn) в нейронах и нейропиле с усилением ее интенсивности в зоне VPLN на границе с RTN. Сетчатая структура баррелоидов в VPMN при этом не выявлялась. Зона RTN таламуса при отмеченной ранее позитивной реакции на NF и MBP была Syn-отрицательной (см. рис. 1, д). Иммуногистохимическое исследование распределения GFAP в области VPLN и VPMN выявило наличие групп астроцитов в зонах проекции вибрисс (см. рис. 1, е). При большем увеличении отчетливо выявлялись нейроноглиоцито-сосудистые комплексы - окрашенные периваскулярные муфты из сосудистых ножек астроцитов вокруг капилляров, а также контакты нейронов с астроцитами, являющиеся морфологической основой гематоэнцефалического барьера (см. рис. 1, ж). Для анализа распределения тормозных нейронов в изучаемых ядрах проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к кальцийсвязывающему белку PА и гормон-подавляющему нейропептиду соматостатину (SS). Наиболее выраженная экспрессия PA и SS наблюдалась в RTN и в области VPMN. Благодаря этому повышенному уровню экспрессии PA на срезе RTN четко отличалась от всех остальных структур (рис. 2, а). При большем увеличении в зоне RTN продукты реакции были локализованы в цитоплазме, ядре, а также в аксонах и дендритах РА-содержащих ГАМК-ергических нейронов, формирующих цепочки и группы (см. рис. 2, б). В зоне VPLN реакция на PA существенно ослабевала, однако, при большем увеличении в нейропиле наблюдалось обилие PA-позитивных отростков, срезанных вдоль и поперек между неокрашенных тел нейронов. Очевидно, что эта зона характеризуется присутствием исключительно PA-позитивных проекций и отсутствием самих PA-позитивных нейронов. По сравнению с VPLN в VPMN была отмечена отчетливая положительная реакция не только в отростках, но и в телах клеток. При этом расположение РА-позитивных структур позволило выявить в этой зоне баррелоиды таламуса на тонких толщиной 4 мкм срезах (см. рис. 2, а). При реакции на SS отдельные клеточные элементы при малом увеличении не визуализировались в отличие от таковых при реакции на PA. Были отмечены горизонтально ориентированные SS-позитивные коллатерали, направленные от RTN через зоны VPMN и VPLN (см. рис. 2, в). Однако при бóльших увеличениях выявлялись небольшие отдельные тела и отростки тормозных SS-позитивных интернейронов (см. рис. 2, г). Экспрессия коннексинов 36 (Cx36) и 43 (Cx43) на телах нейронов и в нейропиле в VPMN, VPLN, RTN более выражена, чем в других основных структурах мозга, располагающихся в плоскости среза - коре, гиппокампе, гипоталамусе и других ядрах таламуса. При этом экспрессия коннексинов в VPMN/VPLN наблюдалась в тех же местах, что и экспрессия РА. Исследование белков нейрональных щелевых контактов (Cx36) выявило цепочки и группы позитивных нейронов в VPMN и VPLN и каких-либо различий в этих зонах не наблюдалось (см. рис. 2, д). При большем увеличении была отмечена яркая, преимущественно цитоплазматическая экспрессия Cx36 на телах нейронов, а также позитивная реакция срезанных вдоль и поперек немногочисленных их отростков (см. рис. 2, е). Исследование белков щелевых контактов астроцитов (Cx43) выявило в большей степени «точечное» окрашивание нейропиля в VPLN, VPMN и RTN, помимо иммунопозитивной мембранной реакции на телах некоторых клеток (только в VPLN, VPMN) (см. рис. 2, ж, з). Также отмечена локализация гранул хромогена вокруг крупных капилляров, что соответствует представлениям о наличии щелевых контактов астроцитов, расположенных вокруг сосудов. Обсуждение полученных данных. Иммуногистохимическое исследование ядер таламуса показало, что на уровне VPMN/VPLN располагаются горизонтально направленные миелиновые и безмиелиновые нервные волокна, в том числе содержащие SS, которые проходят в септах отдельных баррелоидов. Схожая картина была ранее нами описана в баррельной коре: в слое IV наблюдалась группировка пучков NF в тяжи, проходящие преимущественно через септу и стенку баррелей [1]. Также аналогично полученной нами ранее реакции на GFAP в баррелях коры, в VPMN таламуса наблюдается скопление астроцитов в центральной части каждого баррелоида. Схожее расположение астроцитов на 2-м (баррелоиды таламуса) и 3-м (баррели коры) уровнях организации тактильного анализатора может свидетельствовать об особом значении астроцитов для их модульной структуры. Это предположение не лишено оснований, поскольку в литературе встречается достаточное количество данных о регуляции нейрональной активности посредством щелевых контактов астроцитов, расположенных вокруг аксошипиковых химических синапсов через реакцию абсорбции внеклеточных ионов [4]. Согласно имеющимся морфологическим данным, основными клетками VPMN являются нейроны с длинным аксоном и слаборазвитыми дендритами (так называемые релейные клетки). При этом в литературе отсутствуют сведения о наличии в баррелоидах таламуса мелких короткоаксонных интернейронов, выполняющих, предположительно, тормозную функцию. Между тем, проведенное нами исследование вентральных ядер таламуса выявило в таких клетках экспрессию кальций-связывающего белка PA и гормонподавляющего нейропептида SS, являющихся специфическими маркерами тормозных интернейронов. Кроме того, экспрессия РА позволяет идентифицировать баррелоидное поле в VPMN. По литературным данным, выявленные в зоне VPMN клетки, экспрессирующие РА, являются «центрами» таламокортикальных проекций исключительно на средние слои коры [6]. В то же время, нами была отмечена корреляция экспрессии PA и белков щелевых контактов коннексинов (Cx36 и Cx43) в зоне ядер VPLN/VPMN таламуса. Известно, что наибольшее количество нейрональных щелевых контактов, или электрических синапсов, имеют избирательный характер формирования и соединяют тормозные ГАМКергические РА-содержащие интернейроны [3]. Существование такой сети тормозных интернейронов, объединенных электрическими синапсами, может являться морфологической основой индивидуального локального пейсмекерного ритмогенеза как в баррелях и колонках коры SI, так и в баррелоидах VPMN таламуса. Неспецифическое RTN, также как и VPMN, имеет топическую организацию и зону представительства вибрисс [10]. По данным нашего исследования, в RTN наблюдается повышенная по сравнению с другими ядрами таламуса экспрессия MBP, NF, PA и SS, а также умеренная экспрессия GFAP и Cx43. Следовательно, в RTN представлены тормозные РА-и SS-содержащие нейроны, миелиновые и безмиелиновые волокна, что является морфологической основой тормозной функции этого подкоркового образования. Также, как ив VPMN таламуса, экспрессия Cx43 наравне с экспрессией GFAP может свидетельствовать о формировании сети щелевых контактов между распределенными в RTN астроцитами. При этом, в RTN таламуса отсутствует реакция на Syn и Сх36. Таким образом, было выявлено, что миелиновые и безмиелиновые волокна в VPMN и VPLN таламуса имеют горизонтально ориентированное параллельное направление, их наибольшее количество располагается в RTN. Судя по экспрессии нейроглиальных антигенов, баррелоиды таламуса имеют схожее с баррелями строение: между отдельными баррелоидами расположены крупные пучки нервных волокон, дающие реакцию на нейрофиламенты, также в таламических зонах проекции вибрисс имеются скопления астроцитов. Наличие в VPMN и VPLN кальций-связывающего белка PA и гормон-подавляющего нейропептида SS свидетельствует о присутствии специфических тормозных связей в этих ядрах, являющихся «центрами» таламокортикальной передачи в IV слой коры мозга. В исследованных VPMN, VPLN и RTN выявлена более интенсивная экспрессия Сх36 и Сх43, чем в корковых структурах мозга. При этом, в VPMN/VPLN экспрессия коннексинов наблюдается в тех же участках, что и РА. Полученные результаты свидетельствуют о формировании плотной сети глиоцитарных и нейрональных щелевых контактов в исследованных ядрах, способствующих обработке сенсорных сигналов между корой и подкорковыми структурами.

Об авторах

Евгения Юрьевна Кириченко

Южный федеральный университет

Email: kiriche.evgeniya@yandex.ru
лаборатория функциональной нейроморфологии и электронной микроскопии; Академия биологии и биотехнологии им. И. Д. Ивановского 344090, Ростовская область, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1, ауд. 410

Александр Эдуардович Мационис

Ростовское областное патологоанатомическое бюро

Email: matsionis@yandex.ru
отдел экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии 344015, г. Ростов-на-Дону, ул. Благодатная, 170А

Патриция Едмундовна Повилайтите

Ростовское областное патологоанатомическое бюро

Email: povpe@yandex.ru
отдел экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии 344015, г. Ростов-на-Дону, ул. Благодатная, 170А

Марина Анатольевна Акименко

Южный федеральный университет

Email: akimenkoma@yandex.ru
лаборатория функциональной нейроморфологии и электронной микроскопии; Академия биологии и биотехнологии им. И. Д. Ивановского 344090, Ростовская область, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1, ауд. 410

Александр Константинович Логвинов

Южный федеральный университет

лаборатория функциональной нейроморфологии и электронной микроскопии; отдел молекулярно-биологических и оптических методов исследования Центральной научно-исследовательской лаборатории; Академия биологии и биотехнологии им. И. Д. Ивановского 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29

Список литературы

Дополнительные файлы