ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ В НЕРВНОЙ ТКАНИ

Аннотация

Высокая активность кислой фосфатазы в нервных клетках позволяет успешно использовать метод ее выявления для морфофункциональных исследований элементов нервной ткани. На примере нейронов звездчатого узла у коров показано, что тела и отростки нервных клеток имеют разную степень активности фермента. Нервные окончания - постоянно высокую. Метод позволяет проводить детальные морфологические исследования нейронов, а также оценивать их взаимоотношения. В статье приводится подробное описание усовершенствованного метода выявления активности кислой фосфатазы в структурах нервной ткани.

Полный текст

В последние десятилетия широкое распространение получили новые методы исследования, позволяющие на клеточном уровне с успехом изучать разнообразные физиологические и функциональные особенности биологических объектов [10] и практически перестали использоваться гистохимические методы, которые в ряде случаев до сих пор представляют собой несомненную ценность. К таким методам относится метод Гомори, позволяющий выявлять в тканях активность кислой фосфатазы (КФ), которая является важнейшим ферментом, относящимся к группе фосфомоноэстераз, участвующих в фосфорном обмене тканей. Она расщепляет макроергические сложноэфирные связи в моноэфирах фосфорной кислоты с образованием свободного ортофосфата, высвобождением и переносом большого количества энергии [4]. Установлено, что КФ активно участвует в метаболизме клеток, регенерации органов, активизируется при компенсаторных состояниях органов, сокращениях мышц [2]. Большинство работ, связанных с изучением КФ, были направлены на выявление ее специфичности и возможностей диффузии в окружающие структуры. Как показали исследования, КФ широко распространена в природе [4, 8]. Она встречается практически во всех тканях животных и растительных организмов (включая микроорганизмы). Высокая активность КФ выявляется и в нервной ткани [3, 6, 12], содержится в лизосомах, комплексе Гольджи, пиноцитозных пузырьках и выделительных вакуолях, в большом количестве обнаруживается в макрофагах и остеокластах. Генетическое нарушение биосинтеза фосфатаз приводит к заболеваниям, связанным с нарушениями обмена гликогена. В качестве теста определение ее активности используется в клинической практике при лечении онкологических и других заболеваний, применяется в судебной медицине. Разрабатываются методы оценки ее состояния у гидробионтов для решения экологических проблем [8]. Большое количество КФ содержится в нервной ткани. Она участвует в белковом, жировом и углеводном обмене [1, 9]. Цель данной работы - продемонстрировать, что ценность редко используемого метода Гомори заключается в том, что, помимо гистохимического определения активности и локализации одного из важнейших ферментов в структурных элементах нервной ткани, этот метод позволяет изучать и их строение. Метод выявления КФ в тканях на гистологических срезах Гомори разработал в 1941 г. [13], после чего ряд исследователей ввели некоторые изменения, которые позволили улучшить получаемые результаты. Модификация А.Wо1f и соавт. [14] оказалась наиболее удачной для изучения элементов нервной системы. Суть данной гистохимической реакции сводится к необходимости перевода осадка, образующегося в области локализации КФ, сначала в нерастворимое состояние, а затем в видимую его форму. Преимуществом метода выявления активности КФ является возможность использования толстых замороженных гистологических срезов и тотальных препаратов, позволяющих исследовать не только структуру нейронов, но и их взаимоотношения (рисунок, а). Достоинством этого метода является быстрое получение результатов на неограниченном количестве материала. К отрицательным сторонам метода можно отнести использование только свежего материала (крайним сроком являются 12 ч после смерти), что объясняется довольно быстрой инактивацией фермента. Некоторые неудобства представляют продолжительность проведения инкубации срезов (4 ч) и необходимость приготовления препаратов сразу после ее окончания. Возможные затруднения могут возникнуть также при подборе субстрата, на который действует фермент (β-глицерофосфат натрия или α+β-глицерофосфат натрия). При проведении несложного контроля [1], наряду с изучением активности КФ в структурных элементах нейронов (телах, отростках, синапсах, колбах роста, нейрофибриллах), на тех же препаратах представляется возможность изучать и строение нервной ткани (см. рисунок). Помимо синаптических связей между нейронами, которые по методу Гомори выявляются в виде высокоактивных структур, на гистологических препаратах отчетливо выделяются взаимосвязи между нейронами в виде разнообразных форм сплетений отростков. По степени активности КФ можно судить о функциональном состоянии этих образований. Метод Гомори позволяет изучать также афферентные и эфферентные звенья нейронов (см. рисунок, б, в), а в некоторых случаях и нейроглию. В морфологических работах метод Гомори успешно был применен для изучения структур нервной ткани у человека и домашних животных (крупный рогатый скот, собака, кошка, курица) [1-3, 5, 11] и с положительным результатом использован в экспериментальных исследованиях, в частности, при регенерации седалищного нерва, травмах спинного мозга и др. [5, 7, 12]. К сожалению, эти работы не получили дальнейшего развития. Материалом для настоящего исследования послужили звездчатый и чревный узлы автономной нервной системы крупного рогатого скота, полученные на Московском мясокомбинате от 30 животных через 30 мин после их забоя. Также был использован материал от 3 кошек, умерщвленных с помощью эфирного наркоза. Учитывая, что КФ является ферментом, теряющим свою активность при комнатной температуре, весь материал сразу помещали в термос с охлажденным 80º спиртом, затем перекладывали в новый 80º раствор спирта и продолжали фиксировать при температуре -4 ºС в морозильном отделении холодильника в течение 1-2 сут. Усовершенствованная фиксация материала позволила максимально сохранить активность фермента, получить точные сведения о его локализации и четкую морфологическую картину структурных элементов нервной ткани (см. рисунок). Очередность обработки материала. 1. Взятый материал сразу поместить в охлажденную фиксирующую жидкость. Наиболее приемлемым для этого является ацетон и 80º спирт. Так как спирт лучше сохраняет структуру нервной клетки, но несколько инактивирует фермент, поэтому фиксацию необходимо проводить в холодильнике при очень низкой температуре (до -4 ºС). Фиксировать материал в течение 1-2 сут в дважды сменяемом растворе. 2. Материал прополаскать в холодной дистиллированной воде. 3. Изготовить срезы на замораживающем микротоме (криостате) толщиной около 30 мкм и погрузить в холодную дистиллированную воду. 4. Инкубировать срезы в заранее приготовленной среде («субстрате») в термостате при температуре 37-38 ºС в течение 4 ч. 5. После окончания инкубации срезы тщательно сполоснуть в дистиллированной воде при комнатной температуре и погрузить в свежеприготовленный 0,1% раствор сернистого натрия, в котором нерастворимый осадок, выпавший в местах локализации фермента, переводится в видимую форму (срезы приобретают коричневый цвет). 6. После споласкивания в дистиллированной воде комнатной температуры срезы поместить на предметное стекло, обезводить, просветлить и заключить под покровное стекло. Все манипуляции (за исключением инкубации) с каждым срезом проводить отдельно. Нельзя забывать, что весь процесс выявления КФ (как и приготовление и хранение готовых растворов) нужно проводить в химически чистой посуде (бюксиках и стаканчиках). Стеклянный крючок, необходимый для переноса срезов, нужно постоянно споласкивать в дистиллированной воде. Весь описанный процесс выявления активности КФ можно проводить и на парафиновых срезах при условии быстрой заливки материала. Однако результат будет более ограничен по площади срезов, а активность фермента ниже. Очень хорошие результаты получаются при использовании тотальных препаратов, полученных при расслоении стенок полых органов (например кишки). Состав инкубационной смеси. 1. Ацетатная буферная смесь, рН 4,7 - 12 мл. 2. 1/10 М раствор азотнокислого свинца - 10 мл. 3. 2% раствор глицерофосфата натрия (β-глицерофосфат натрия или α+β-глицерофосфат натрия) - 6,5 мл. 4. Добавить дистиллированную воду до 100 мл. Образовавшийся осадок профильтровать. Приготовление растворов для инкубационной смеси. 1. Ацетатная буферная смесь (если нет готового раствора), рН 4,7: 1) дистиллированная вода 200 мл; 2) ледяная уксусная кислота 12 мл. 3) дистиллированная вода 300 мл; 4) ацетат натрия 39,9 г. 5) растворы слить, проверить рН. 2. 1/10 М раствор нитрата свинца: 1) дистиллированная вода 100 мл; 2) нитрат свинца 3,3 г. Способы контроля гистохимический реакции. 1. Инактивация срезов при температуре 80 ºС в течение 10 мин или при 90 ºС - 5 мин. Далее - инкубация и все по прописи. 2. Добавить в инкубационную среду 0,01 М раствора фтористого натрия. 3. Исключить из инкубационной среды субстрат (глицерофосфат натрия) и добавить вместо него дистиллированной воды. Особо следует отметить модификацию метода Гомори, которую предложил А. М. Чилингарян [9] для выявления подслизистого и межмышечного сплетений. Она заключается в том, что отпрепарированный наружный продольный слой мышечной оболочки кишки (вместе с межмышечным нервным сплетением) перед инкубацией предварительно нужно опустить в нагретую до 72 ºС дистиллированную воду на 5 мин, а затем перенести в дистиллированную воду при комнатной температуре. Этот прием позволяет наиболее полно продемонстрировать состав нейронов, включая мелкие, которые до этого либо не выявлялись, либо выявлялись, но неполностью. Кроме того, инактивация фермента, находящегося в окружающих тканях кишки, способствует более четкой дифференциации структурных элементов нейронов и внутриганглиозных взаимоотношений. Этот метод в дальнейшем был успешно применен и другими исследователями [11]. Таким образом, метод выявления активности КФ, предложенный Гомори, в модификации A. Wolf и соавт. [14] является ценным методом, позволяющим, наряду с определением ее активности в структурных элементах нейрона при соблюдении правильной фиксации материала, проводить полноценные исследования как центральной, так и периферической нервной системы. В морфологических исследованиях его возможности полностью не исчерпаны.