AGE-RELATED PATTERNS OF CHANGES IN THE SPLENIC WHITE PULP IN HETEROTYPIC STRESS: EXPERIMENTAL IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY

全文:

Широкий диапазон иммуномодулирующих действий стресса от стимулирующего до глубокого угнетающего на иммунную систему организма человека и экспериментальных животных обнаружен в многочисленных исследованиях последних лет [7, 16]. Вектор стресс-ассоциированной иммуномодуляции зависит от многих факторов, как внешних, так и внутренних, среди которых ведущими внешними считаются продолжительность и тип стрессорного воздействия, а внутренними - возраст, пол испытуемого, тип приспособительного поведения и предыдущий опыт стрессорных экспозиций [6, 10]. Известно, что почти все клеточные элементы, участвующие во врожденном и приобретенном иммунитете, подвержены возрастному ремоделированию [18]. Действие на организм любых иммуномодулирующих факторов, в том числе таких, как хронический стресс, во время активного роста способствует наложению возрастных изменений на индуцированные, что может оказать значительное воздействие на иммунный ответ. Принято считать, что хронический стресс является иммунодепрессивным, однако механизмы иммуносупрессии по-прежнему нуждаются в дальнейшем изучении, что даст возможность разрабатывать адресные биоповеденческие рекомендации или фармакологические методики, направленные на минимизацию иммуносупрессивных последствий стресса с целью укрепления здоровья и ускорения выздоровления [2, 13, 15]. В последнее время появились целый ряд работ, посвященных изучению влияния хронического гетеротипического стресса, т. е. cтрессорного воздействия с меняющимся стрессором, которое чаще всего влияет на организм современного человека [3, 14], затрагивая главным образом нейроэндокринную систему. Продемонстрировано, что активация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси при повторном действии гомотипического стресса снижается, а гетеротипического, напротив, усиливается [11]. Влияние гетеротипического стресса на иммунную систему растущего организма, в частности на морфологические особенности иммунных органов, остается практически неизученным. Цель данного исследования - сравнительная оценка иммуномодулирующего действия стресса на строение селезенки при действии гомо- и гетеротипических стрессоров в различные возрастные периоды у крыс до наступления половой зрелости. Материал и методы. Протокол исследования одобрен этическим комитетом научных исследований с использованием экспериментальных животных медицинского факультета Университета Технологии МАРА, протокол ACUC 4-11 от 14.04.2011 г. Исследование выполнено на 48 крысах породы Спрег-Доули в возрасте 20 и 45 сут, что соответствовало инфантильному и перипубертатному периодам постнатального развития. На момент окончания эксперимента возраст был 28 и 53 сут соответственно [17]. В каждой возрастной группе, включающей 24 особи, животных подразделяли на 3 подгруппы: контрольную и 2 экспериментальные для моделирования [5] хронического гомотипического и гетеротипического стресса. В качестве гомотипического стрессорного воздействия применялся стресс «избегания воды», а в качестве гетеротипического - использовалась непредсказуемая последовательность действия трех стрессоров: «избегания воды», водной иммерсии и иммобилизации при температуре 4 ºС. Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре +20...20 ºС с доступом к воде и пище ad libitum. Экспериментальных животных ежедневно на протяжении 9 сут по 2 ч в день, начиная с 9 ч утра, подвергали стрессорному воздействию, в то время как животные групп возрастного контроля находились вне аудио-и видеодосягаемости от экспериментальных животных. После последнего сеанса стресса животных под анестезией декапитировали, селезенку извлекали, фиксировали формалином и заливали в парафин. Гистологические срезы селезенки окрашивали гематоксилином - эозином и иммуногистохимически поликлональными антителами к белку S100 (Дaко, Дания, Z0311), а также моноклональными антителами к PCNA (клон PC10) - ядерного антигена пролиферирующих клеток (AbDSerotec, США, MCA1558); CD4 (клон W3/25) - маркеру Т-хелперов и тимоцитов (AbDSerotec, США, MCA55); CD8 (клон MRC OX8) - маркеру тимоцитов, Т-клеток и NK-клеток (AbDSerotec, США, MCA48), CD90 (клон HIS51) - маркеру тимоцитов, недавних тимусных иммигрантов (BD Biosciences, #550570), каспазы-3 - маркеру апоптоза (AbDSerotec, США, #AHP476), ОХ62 (клон MRC OX62) - маркеру дендритных клеток (AbDSerotec, США, MCA1029); СD20 (клон R1N9D3) - маркеру пре-и зрелых В-лифмоцитов (AbDSerotec, MCA#1432). Для визуализации применяли стрептавидин-биотинпероксидазный метод по стандартным методикам в соответствии с рекомендациями производителей реактивов. Удельные площади иммунопозитивных клеток, окрашенных диаминобензидином в коричневый цвет, оценивали морфометрически с применением программы Image-Pro+ 8.0 (Media Cybernetics, США), транспортирующей цифровые данные в программу Exсel. Определяли среднюю арифметическую величину, среднеквадратическое отклонение, ошибку репрезентативности. Оценку значимости различий сравниваемых величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Критическим уровнем значимости считали P<0,05. Результаты исследования. Хронический стресс при действии как гомо-, так и гетеротипических стрессоров вызывал микроскопические изменения в селезенке. Они заключались в уменьшении объема Т-иВ-зон белой пульпы, маргинальной зоны вокруг них, снижении плотности расположения клеток как в Т-зонах (периартериальные лимфоидные влагалища), так ивВ-зонах (лимфоидные узелки), а также увеличении в них количества макрофагов с неокрашенной цитоплазмой, захвативших апоптозные тельца. Иммуногистохимическая реакция на различные группы дендритных клеток, лимфоцитов и клеток, гибнущих путем апоптоза (рис. 1), показала влияние обоих видов стресса на динамику данных клеточных популяций. Хронический стресс, как гомо-, так и гетеротипический, вызывал значимое уменьшение удельной площади как Т-, так и B-клеточных популяций в обеих возрастных подгруппах, причем при действии гетеротипических стрессоров это снижение было более выраженным, с неодинаковым уровнем значимости различий в экспериментальных группах у отдельных субпопуляций лимфоцитов (рис. 2, а-г). Доля CD8+-и CD4+-лимфоцитов снижалась значимо в обеих экспериментальных группах с бóльшим уровнем различий у животных перипубертатного возраста, чем инфантильного (см. рис. 2 а, в). Количество CD90+-и CD20+лимфоцитов уменьшилось значительнее у инфантильных животных, чем в перипубертатном возрасте. При гетеротипическом стрессе в обеих возрастных группах снижение данного показателя было более выраженным (см. рис. 2, в, г). Хронический стресс оказывал также влияние на возрастную динамику двух популяций стромальных клеток: OX-62-и белок S100иммунопозитивных. У инфантильных животных число OX-62+-клеток при стрессе менялось незначительно, в то время как у крыс перипубертатного возраста оно значимо снижалось при действии обоих видов стрессоров с минимальными различиями между двумя экспериментальными группами (см. рис. 2, д). Удельная площадь фолликулярных дендритных клеток имела другую динамику: при гомотипическом стрессе она значимо снижалась лишь у животных инфантильного возраста, в то время как при гетеротипическом стрессе - в обеих возрастных группах, причем с бóльшим уровнем значимости, чем при гомотипическом стрессе (см. рис. 2, е). Для выяснения механизмов стресс-ассоциированной динамики популяций лимфоидных и дендритных клеток был проведен анализ содержания PCNA-и каспаза-3-иммунопозитивных клеток. Оказалось, что удельная площадь клеток, несущих маркер апоптоза, значимо увеличивается в обеих возрастных группах лишь при гетеротипическом стрессе, причем с бóльшим уровнем значимости у животных в перипубертатном возрасте (см. рис. 2, ж). Содержание PCNAиммунопозитивных клеток при действии гомотипического стресса у животных обеих возрастных подгрупп изменялось незначительно, а в то время как при гетеротипическом стрессе значимо снижалось (см. рис. 2, з). Обсуждение полученных данных. В литературе имеются данные о действии различных по силе («мягкий» и «жесткий»), характеру (системный или процессивный) гомотипических стрессоров на иммунную систему растущего организма [1, 12]. Однако сведений о влиянии гетеротипических стрессоров на лимфоидные органы весьма немного. В единичных исследованиях, посвященных адаптационным процессам при гетеротипическом стрессе в растущем организме, представлены в основном нарушения в нейроэндокринной и сердечно-сосудистой системе, в то время как исследования иммунных органов ограничиваются данными о массе тимуса [4, 8, 9]. Нами показано, что изменения, затрагивающие популяции лимфоидных и стромальных клеток в селезенке, а также интенсивность пролиферации и апоптоза иммуноцитов в различные периоды раннего постнатального онтогенеза при хроническом действии гетеротипических стрессоров, различаются и превосходят по значимости изменения при гомотипическом стрессе. Применение иммуногистохимических методов исследования и имидж-анализа позволяет выявить динамику стресс-ассоциированных изменений в селезенке у экспериментальных животных и продемонстирировать возрастные различия реакций на действие гомо-и гетеротипических стрессоров в двух возрастных группах у крыс. Исследование показало, что изменения в селезенке растущего организма при хроническом действии гомо-и гетеротипических стрессоров различаются по динамике клеточных популяций лимфоцитов и дендритных клеток, уровнями апоптоза и пролиферации клеток в ее Т-иВ-зонах. По нашим данным, диапазон этих различий связан с возрастными особенностями активации гипоталамогипофизарно-адренокортикальной оси при хроническом стрессе. Полученные данные демонстрируют, что нейроэндокринные и иммунные изменения, опосредованные различными видами стресса (гомо-или гетеротипического), накладываются на сложные возрастные перестройки органов иммунной и эндокринной систем, наблюдаемые до наступления половой зрелости, что формирует различные иммуномодуляционные изменения при гомо-и гетеротипическом стрессе на разных этапах раннего постнатального онтогенеза. Полученные данные могут использоваться при разработке адресных мер профилактики иммуносупрессивных нарушений в растущем организме, пережившем хроническое действие гомо-или гетеротипических стрессоров. Таким образом, использование морфологических методов исследования позволяет не только констатировать наличие изменений в различных популяциях иммуноцитов под влиянием стрессоров, но локализовать их по отделам лимфоидных органов. Проведенное нами исследование показало наличие иммуносупрессивных изменений в селезенке у неполовозрелых крыс, состав и выраженность которых различались у животных разных возрастных групп (инфантильного и перипубертатного возраста) при хроническом действии гетеротипических стрессоров по сравнению с гомотипическим стрессом.

作者简介

M. Kapitonova

Universiti Teknologi MARA

Email: marinakapitonova@mail.ru
Department of Anatomy,, Faculty of Medicine

S. Fuad

Universiti Teknologi MARA

Email: sbsaf11@gmail.com
Department of Anatomy,, Faculty of Medicine

S. Kuznetsov

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: vakmedbiol@rambler.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

S. Dydykin

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dydykin_ss@mail.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

D. Chernov

I. M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: blackdi85@yandex.ru
Department of Histology, Cytology and Embryology

M. Nor-Ashikin

Universiti Teknologi MARA

Email: noras011@salam.uitm.edu.my
Department of Anatomy,, Faculty of Medicine

A. Ahmad

Universiti Teknologi MARA

Email: biotech.azhar@gmail.com
Department of Anatomy,, Faculty of Medicine

参考

补充文件