СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЕЧЕНИ И ЗВЕЗДЧАТЫХ МАКРОФАГОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ МЫШЕЙ ЛИНИЙ CBA И C57BL/6

Полный текст

Звездчатые макрофаги (ЗМ) (клетки Купфера) играют ключевую роль в процессах формирования различных (острых и хронических) патологических изменений в печени, воспалительной реакции при развитии бактериальной, вирусной инфекции, а также при повреждении этого органа ксенобиотиками, радиацией и при стрессе [6, 10-12, 15]. При этом как активированные, так и супрессированные ЗМ взаимодействуют с гепатоцитами и другими клетками печени [10], секретируя различные биологически активные вещества [9]. Медиаторы ЗМ способны влиять на гепатоциты противоположным образом: они могут повреждать гепатоциты и даже вызывать их гибель или же защищать эти клетки от повреждения [9], стимулировать их пролиферацию, уменьшать апоптоз эндотелиальных клеток синусоидов [10], интенсивность фиброзирования [13, 14]. Важным вопросом в медицинских и биологических исследованиях является генетическая детерминация проявлений индивидуальной чувствительности особей к экстремальным факторам и особенностей реагирования их систем и органов. Для этих целей проводят исследования на генетически однородных животных разных линий. В частности, мыши линий СВА и С57Вl/6 являются противоположными по целому ряду биологических параметров их органов и регуляторных систем [4-8]. Больше внимание уделяется патологии перинатального периода, поскольку спектр и степень влияния материнских и перинатальных факторов впоследствии определяют особенности формирования постнатальной заболеваемости и развития инвалидизирующей патологии [4]. В этой связи исходное морфофункциональное состояние печени плода и новорожденного может повлиять в последующие периоды жизни на особенности реагирования печени (компенсаторные реакции, масштабы деструктивных изменений, воспалительные проявления) как защитного органа, что отражается на состоянии организма в целом. Однако морфофункциональное состояние ЗМ в перинатальный период развития с учетом их ключевой роли в поддержании гомеостаза печени, в патогенезе развития заболеваний в этом органе, а также значимость этих клеток в обеспечении индивидуальных особенностей организма недостаточно исследованы. Поэтому цель настоящего исследования - сравнительное изучение морфологических особенностей печени и ультраструктуры ЗМ у новорожденных мышей двух оппозитных линий в условиях физиологической нормы. Материал и методы. Исследования проведены на 20 новорожденных мышах оппозитных линий СВА иС57Вl/6. Животные-производители были получены из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Взрослых животных содержали в пластмассовых клетках (по 5 мышей - 1 самец и 4 самки) в стандартных условиях вивария при естественном освещении на гранулированном комбикорме «ПК 120-3» (Лабораторснаб, Россия) и воде ad libitum. Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986), принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р53434-2009 от 01.03. 2010 г. идентичен GLPOECD). Новорожденных мышей (1-е сутки жизни) декапитировали под эфирным наркозом. Для светооптического исследования образцы печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, по Ван-Гизону, аргирофильные волокна выявляли путем импрегнации нитратом серебра по Гордону-Свиту [2] и исследовали под световым микроскопом Axioscopstar plus (Zeiss, Германия), изображения были получены при помощи цифровой видеокамеры Axiocam ICc 3 (Zeiss, Германия). В 10-15 полях зрения каждого препарата от 10 мышей в каждой группе, используя окулярные морфометрические сетки, состоящие из 25 и 289 тестовых точек [1], определяли объемную плотность (Vv) очагов экстрамедуллярного кроветворения, аргирофильных волокон, гибнущих гепатоцитов, двуядерных гепатоцитов и гепатоцитов с вакуолизированной цитоплазмой; численную плотность (Na) двуядерных гепатоцитов, гепатоцитов в состоянии митоза, мегакариоцитов. Для электронно-микроскопического исследования образцы печени объемом 1 мм3 в количестве 7-8 от одного животного, фиксировали в 1% водном растворе тетраоксида осмия при температуре 4 ºС, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, заключали в эпоксидные смолы с использованием компонентов из набора SPI-PON 812 KIT (SIGMA chemical company, Швеция). Срезы толщиной 1 мкм окрашивали (при нагревании) 1% раствором метиленового голубого в 1% растворе тетрабората натрия. Ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм, изготовленные на ультрамикротоме (LKB, Швеция) последовательно контрастировали в растворах ацетата уранила и цитрата свинца по Reynolds [3]. Электронно-микроскопическое исследование звездчатых макрофагов проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100/ASID/SEGZ (Jeol, Япония) при конечном увеличении 56 000 раз. Исследование ультраструктур ЗМ осуществляли по негативным изображениям их срезов, спроецированных на многоцелевую квадратную открытую тестовую систему. На электронно-микроскопических фотографиях ЗМ определяли объемную плотность (Vv) цитоплазмы, первичных и вторичных лизосом, митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети (ГЭПС); поверхностную плотность (Sv) мембран митохондрий, ГЭПС, для оценки плотности внутренних мембран митохондрий и ГЭПС рассчитывали соотношение показателей Sv/Vv митохондрий и ГЭПС; численную плотность (Na) первичных и вторичных лизосом, митохондрий. Статистическую обработку данных морфометрического исследования проводили с использованием лицензированного пакета программ Microsoft Excel c определением средней величины и ее стандартной ошибки. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента. Критическим уровнем значимости считали P<0,05. При расчетах учитывали нормальность распределения исследуемого количественного признака [медиана близка к среднему значению (расхождение не более 20%)]. Результаты исследования. В печени у новорожденных мышей линий СВА и С57Вl/6 наблюдали многочисленные очаги экстрамедуллярного кроветворения, гепатоциты располагались рыхло, внутри долек печёночные пластинки не были сформированы (рисунок, а), аргирофильные волокна были слабо выражены. При сравнительном морфометрическом исследовании печени мышей линий СВА и С57Вl/6 были выявлены межлинейные различия по показателям объемной плотности гибнущих клеток, численной плотности гепатоцитов в состоянии митоза и мегакариоцитов: значения этих показателей были бóльшими у новорожденных мышей линии С57Вl/6, чем у мышей линии СВА в 3,9; 2,9; 2,1 раза соответственно. Различий в показателях объемной плотности очагов экстрамедуллярного кроветворения и аргирофильных волокон в сравниваемых группах животных не выявлено (табл. 1). При электронно-микроскопическом исследовании ультраструктур ЗМ (см. рисунок, б, в) в печени у новорожденных мышей сравниваемых линий также были выявлены различия по ряду показателей. Так, величины объемной и поверхностной плотностей ГЭПС были бóльшими у мышей линии C57Bl/6, чем у мышей линии СВА, в 1,22, 1,91 раза соответственно, а соотношение величин Sv/ Vv ГЭПС - в 1,55 раза. Численная плотность прикрепленных рибосом у мышей линии С57Вl/6 превышала в 2,71 раза таковую у мышей линии СВА (табл. 2). Численная плотность митохондрий ЗМ, расположенных преимущественно в околоядерной области (см. рисунок, б), была в 1,9 раза больше у новорожденных мышей линии СВА, чем у мышей линии C57B1/6. При этом соотношение показателей Sv/Vv митохондрий было больше у новорожденных мышей линии C57Bl/6 в 1,69 раза (см. табл. 2). Численная плотность первичных лизосом также была больше у новорожденных мышей линии С57Вl/6 в 1,54 раза, чем у мышей линии СВА (табл. 3). Однако межлинейных различий по численной плотности вторичных лизосом в сравниваемых группах выявлено не было (см. табл. 3). Объемная плотность цитоплазмы ЗМ у мышей линии СВА в 1,47 раза превышала таковую у мышей линии C57Bl/6 (см. табл. 2). Обсуждение полученных данных. В результате проведенного сравнительного морфологического и морфометрического исследований структуры печени и ЗМ в условиях физиологической нормы выявлены генетически детерминированные различия у новорожденных мышей линий СВА и С57Вl/6. Морфофункциональные особенности структуры печени и ЗМ у новорожденных мышей линии C57Bl/6, вероятно, отражают более высокие уровни как физиологической регенерации (увеличение численной плотности гепатоцитов в состоянии митоза), так и бóльшие темпы физиологической смены популяции гепатоцитов (увеличение численной плотности гибнущих гепатоцитов) у мышей линии C57Bl/6 [10]. Можно допустить, что более активные ЗМ у новорожденных мышей линии C57Bl/6 способствуют гибели наиболее поврежденных гепатоцитов и стимуляции пролиферации неповрежденных [9]. Эти результаты согласуются с данными об устойчивости животных линии С57Вl/6 к воздействию многих факторов, провоцирующих развитие различных патологических состояний [4-8]. Межлинейные различия в ультраструктурной организации ЗМ, прежде всего, касались белоксинтезирующего аппарата (ГЭПС и рибосом) и митохондрий, в меньшей степени - лизосом и фаголизосом. Более развитая сеть мембран, формиру ющих ГЭПС, и обилие прикрепленных к ним рибосом в ЗМ у новорожденных мышей линии C57Bl/6, по сравнению с таковой у линии СВА, по нашему мнению, являются отражением состояния их исходно высокой синтетической и секреторной активности. По-видимому, у мышей линии C57Bl/6 ЗМ способны активно за счет медиаторных эффектов выполнять адаптационную функцию в условиях физиологической нормы и патологии. Вследствие этого возможно формирование условий для селекции гепатоцитов по критерию неспецифической резистентности [9]. Численная плотность первичных лизосом, являющихся производными эндоплазматической сети комплекса Гольджи, по нашим данным, оказалась большей у мышей линии C57Bl/6, чем у мышей линии СВА. Это могло стать результатом более развитой сети каналов ГЭПС у мышей данной линии [6]. Продуктылизосомальногопротеолиза при дефиците источников энергии могут быть использованы для энергетических и пластических потребностей клеток, в этом выражается сущность «реконструктивной» функции лизосом [6]. В этой связи можно предположить, что ЗМ у мышей линии C57Bl/6 могут создавать условия, с одной стороны, для эффективной противоинфекционной защиты за счет элиминации возбудителя в фаголизосомах, с другой - иметь значительный гидролитический потенциал, способный при действии определенных триггерных механизмов привести к повреждению клеток печени [6]. Объёмная и поверхностная плотность митохондрий ЗМ значимо не различались у мышей исследованных линий. В то же время, наблюдаемое увеличение соотношения показателей Sv/ Vv митохондрий ЗМ у мышей линии C57Bl/6 указывает на потенциально высокую энергообеспеченность клетки, и, вероятно, свидетельствует о более высоких исходных функциональных возможностях ЗМ у новорожденных мышей этой линии. Выявленные закономерности позволяют считать, что в условиях патологии возможно значительное увеличение функциональной активности митохондрий ЗМ у животных линии C57Bl/6 [6]. Полноценность функциональной адаптации организма в значительной степени определяется его исходным состоянием в начале постнатального периода развития. В этой связи, выявленные различия морфометрических параметров звездчатых фагоцитов и структуры печени у новорожденных мышей оппозитных линий CBA и C57Bl/6, могут способствовать дальнейшему изучению влияния внутриутробной патологии на адаптацию печени и организма в целом в его последующем развитии.

Об авторах

Софья Павловна Мозолева

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: mozzes83@gmail.com
кафедра патологической анатомии 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

Александр Петрович Надеев

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: nadeevngma@mail.ru
кафедра патологической анатомии 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

Светлана Васильевна Позднякова

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: svetpozdnykova@yandex.ru
кафедра патологической анатомии 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

Светлана Васильевна Залавина

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: zalavinasv@mail.ru
кафедра патологической анатомии 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

Список литературы

Дополнительные файлы