ИЗМЕНЕНИЯ СТРОЕНИЯ И ФРАКТАЛЬНОЙ РАЗМЕРНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА (ИССЛЕДОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ)

Полный текст

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет получать изображения живых объектов с высоким разрешением и обладает целым рядом преимуществ: возможностью исследовать клетки в нативной среде в режиме реального времени, определять вязко-упругие свойства мембранно-цитоскелетных комплексов, адгезивные характеристики молекул, в перспективе - определять локальный потенциал клеточных мембран [5]. Одним из существенных преимуществ АСМ является получение высокоточных морфометрических характеристик молекул, надмолекулярных комплексов и клеток. Измерения диаметра и высоты позволяют ориентироваться не только на субъективную информацию об изменении строения клеток, но и предоставляют точную количественную оценку этих изменений. В процессе выполнения основных физиологических функций эритроциты деформируются [4]. Однако, наряду с физиологической деформацией клеток при ряде заболеваний и при воздействии неблагоприятных факторов, эритроциты трансформируются в патологические формы, которые в норме не встречаются. Цель настоящей работы - определить различия высоты, диаметра и фрактальной размерности трансформированных эритроцитов по данным, полученным методом АСМ; выявить основные изменения строения эритроцитов после воздействия наночастиц магнетита (НЧМ). Материал и методы. Исследовали 23 образца венозной крови здоровых доноров обоих полов в возрасте от 20 до 40 лет, полученных в Нижегородском областном центре крови им. Н. Я. Климовой. На проведение исследования получено разрешение комиссии по биоэтике Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (№ 9 от 17.07.2017 г.). После однократного центрифугирования гепаринизированной крови (50 ЕД/мл) при 200 G в течение 3 мин и декантирования плазмы и лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя эритроциты пятикратно отмывали забуференным изотоническим раствором хлорида натрия (ЗИРХН). Отбирали 20 мкл эритроцитов, разводили в 50 раз, начальная концентрация клеток составляла 1×106 кл/мл. Эритроциты инкубировали с НЧМ в соотношении 1:1 (опыт) или с эквивалентным количеством ЗИРХН (контроль) в течение 60 мин при температуре 37 ºС [6]. Наночастицы магнетита (FeO•Fe2O3), предоставленные кафедрой физики полупроводников Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского (руков. исследовательской группы - проф. Д. А. Горин), получали методом химической преципитации из раствора солей двух-и трехвалентного железа [1]. На двуугловом анализаторе размеров частиц и молекул ZetasizerNano («Malvern Instruments Ltd.», Великобритания) измеряли гидродинамический диаметр и электрокинетический потенциал (ζ-потенциал) НЧМ. Показатели составили 20±4 нм и -13,09 мВ соответственно. НЧМ перед экспериментами взбалтывали в перемешивающем устройстве Vortex (ELMI Ltd., Латвия) в течение 10 мин, диспергировали в ультразвуковой ванне (РЭЛТЭК, Москва) продолжительностью 15 мин, добиваясь однородности, после чего использовали для инкубации с эритроцитами в конечной концентрации 0,0018 мг/мл. Эритроциты переносили на поверхность предметных стекол и фиксировали глутаровым альдегидом (2,5 %; 20 мин; 24 ºС), трижды отмывали и сканировали в полуконтактном режиме на воздухе с помощью АСМ Ntegra Spectra (NT-MDT, Россия). Для обработки результатов сканирования использовали программный пакет Gwyddion (Чешский метрологический институт, Чехия). Использовали зонды DNP (Bruker, CША) с радиусом закругления кончика 20 нм, углом при вершине 15º, резонансной частотой около 65 кГц, константой жёсткости 0,35 Н/м. Измерения диаметра и высоты проводили по боковому сечению профиля клетки (рис. 1). Фрактальную размерность клеток рассчитывали на основе данных сканирования с помощью метода подсчета кубов [8]. Графическим методом определяли CL50 (50 % летальную концентрацию) для НЧМ. Она составила 1,712 мг/мл. Поскольку в биологических исследованиях и медицинской практике используются гораздо более низкие концентрации [2, 7], для эксперимента брали 0,0018 мг/мл НМЧ, т. е. сублетальную концентрацию, вызывающую трансформацию эритроцитов, а не их гемолиз. Значимость различий между двумя выборками полученных количественных данных определяли методом непараметрической статистики с использованием двухвыборочного критерия Вилкоксона. Различия между выборками считали статистически значимыми при р<0,05. Для статистического анализа использовали программу Origin Pro 8 (OriginLabCorparation, США). Результаты исследования. На рис. 1 представлен нормальный по форме эритроцит (нормоцит). Результаты измерений основных морфометрических характеристик эритроцитов представлены в таблице. Поскольку у большинства трансформированных форм зона пеллора (центрального просвета) не оформлена, для измерения высоты всех эритроцитов, в том числе нормоцитов, брали самую высокую точку клетки (у нормоцита она находится в области тора). Воздействие НЧМ на эритроциты вызывало их трансформацию. Наиболее часто встречались такие измененные формы, как сфероциты, затем эхиноциты, кодоциты и наименее часто - стоматоциты (рис. 2). Сфероциты имели округлую, предгемолитическую форму, на микроструктуре их мембраны отчетливо визуализировались повреждения (см. рис. 2, а). Эхиноциты представляли собой сферические клетки, на поверхности которых располагались 30-50 сопоставимых по размеру спикул (см. рис. 2, б). Кодоциты - это мишеневидные клетки с куполообразным выбуханием в центре, часть поверхности которых в зоне тора могла быть повреждена (см. рис. 2, в). Стоматоциты - округлые клетки с щелевидной формой пеллора (см. рис. 2, г). Наряду с ними, крайне редко встречались дакриоциты, акантоциты и трудно дифференцируемые формы эритроцитов, в том числе эритроциты, имеющие перфорации на уровне мембраны [4] и кексообразные эритроциты (ранее не описаны). Эритроциты, имеющие перфорации на мембране, не были гемолизированы. Однако они имели форму, отличную от торообразной или сферической, но близкую к многограннику с тупыми углами, а глубина перфораций варьировала от 25 до 304 нм (см. рис. 2, д). Кексообразные эритроциты характеризовались выбуханием на вершине, характерным и для кодоцитов, однако, в отличие от последних, это выбухание имело многослойный характер, а пеллорическая зона абсолютно отсутствовала (см. рис. 2, е). Общее количество редко встречающихся форм было менее 2 %, поэтому статистический анализ их морфометрических характеристик был невозможен. По высоте от нормоцитов значимо отличаются эхиноциты и стоматоциты (см. таблицу). Между трансформированными формами значимые различия по высоте клетки отмечались между сфероцитами и эхиноцитами, сфероцитами и стоматоцитами, эхиноцитами и кодоцитами, кодоцитами и стоматоцитами. По диаметру значимо от нормоцитов отличались только эхиноциты. Между трансформированными формами значимые отличия по диаметру клетки отмечались между сфероцитами и стоматоцитами, эхиноцитами и стоматоцитами. По фрактальной размерности все трансформированные формы значимо отличались от нормоцитов (см. табл.). Между трансформированными формами значимые отличия во фрактальной размерности отмечались между сфероцитами и эхиноцитами, сфероцитами и кодоцитами, сфероцитами и стоматоцитами, эхиноцитами и стоматоцитами. Обсуждение полученных данных. Согласно литературным данным [3], к обратимым формам эритроцитов относят эхиноциты и стоматоциты, к необратимым - кодоциты и сфероциты. Эритрограмма в контроле (без воздействия) выглядит следующим образом: 88,9 % - нормоцитов; обратимых форм 5,3 % (из них 4,3 % - эхиноцитов и 1 % - стоматоцитов); необратимых форм - 5,8 % (из них 2,4 % - сфероцитов, 3,4 % - кодоцитов). При воздействии НЧМ наблюдается смещение эритограммы в сторону необратимых форм: 51,4 % - нормоцитов, общее количество обратимо трансформированных форм составляло 12 % (из них 10 % - эхиноцитов, 2 % - стоматоцитов), необратимых форм - 36,6 % (из них 30,6 % - сфероциты, 6 % - кодоциты). Альтерация эритроцитов под влиянием НЧМ проявляется в изменении формы эритроцитов, их морфометрических параметров и смещении эритрограммы в сторону необратимых форм (сфероцитов и кодоцитов). Однако морфометрический анализ трансформированных форм эритроцитов с последующей статистической обработкой, как правило, не позволяет выявить параметры, достаточно чувствительные для диагностического дифференцирования нормоцитов от трансформированных форм эритроцитов. Это связано, прежде всего, с крайне высокой вариабельностью всех параметров у трансформированных эритроцитов. АСМ является высокоразрешающим и высокоточным методом измерения, поэтому позволяет количественно выявить эти колебания. Полученные данные дают представление о том, что групповые различия нормоцитов с трансформированными формами наблюдаются не только в случае значительных различий средних значений выборок, но и в случае малых значений их коэффициентов вариации. Исключение составляет показатель фрактальной размерности, являющийся наиболее чувствительным критерием, позволяющим не только дифференцировать нормоциты от трансформированных форм, но и различить трансформированные формы между собой. Это обусловлено тем, что фрактальная размерность является мерой заполнения пространства исследуемой структурой. Поэтому любые изменения строения эритроцитов приводят к отклонению от «идеальной» торообразной формы эритроцитов и, как следствие, к уменьшению этого параметра. Фрактальная размерность является математической характеристикой формы клетки, составляющая максимальную величину у нормоцита. Для всех трансформированных форм эритроцитов фрактальная размерность статистически значимо уменьшается. Минимальное значение фрактальной размерности выявлено для предгемолитической формы - сфероцита. Это говорит о том, что все трансформированные формы эритроцитов имеют меньшую эффективную площадь поверхности, что снижает их функциональные возможности, например, нарушаются газообменная функция и функция транспорта веществ. Таким образом, даже низкая концентрация НЧМ (в 103 меньшая CL50) способна вызвать существенную трансформацию эритроцитов с выраженным смещением в сторону необратимых форм. Метод АСМ позволяет с высокой точностью измерить высоту, диаметр и фрактальную размерность клетки. Однако единственным высокочувствительным параметром, позволяющим на основе морфометрических измерений дифференцировать нормоциты от трансформированных форм эритроцитов, является фрактальная размерность. Авторы выражают искреннюю признательность сотрудникам Саратовского национального исследовательского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского д-ру хим. наук проф. Д. А. Горину и канд. хим. наук С. В. Герману за синтез и предоставление наночастиц магнетита. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект № 16-14-10179. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: С. Н. П. Сбор и обработка материала: Р. Н. К. Статистическая обработка данных: Р. Н. К., С. Ю. З. Анализ и интерпретация данных: С. Н. П. Написание текста: С. Н. П., Р. Н. К., С. Ю. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Светлана Николаевна Плескова

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского

Email: pleskova@mail.ru
Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур» 603022, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, к. 3

Руслан Николаевич Крюков

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского

Email: kriukov.ruslan@yandex.ru
Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур» 603022, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, к. 3

Сергей Юрьевич Зубков

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского

Email: zubkov@phys.unn.ru
Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур» 603022, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, к. 3

Список литературы

Дополнительные файлы