СТРУКТУРНЫЕ И БИОМЕХАНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ НА ФОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА (ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ)

Полный текст

Динамичное развитие нанотехнологий привело к разработке широкого спектра материалов, содержащих наночастицы (НЧ). Использование НЧ в различных целях растет с каждым годом в связи с тем, что в наноразмерном состоянии (<100 нм) любые вещества приобретают новые химические, физические и биологические свойства, улучшающие качество многих фармацевтических и медицинских изделий. Малый размер НЧ позволяет им вступать во взаимодействие с биологическими структурами, проникая внутрь клеток. Благодаря этому использование НЧ перспективно для создания новых медицинских технологий для диагностики заболеваний, биоимиджинга и адресной доставки лекарственных средств [9, 14]. В последнее десятилетие специалисты в области нанотехнологий и наномедицины объединены поиском средств для противораковой терапии. Усилия направлены не только на изыскание биоактивных веществ, но и на способ целенаправленной доставки химиотерапевтических средств в опухолевые клетки. В качестве перспективного инструмента для лечения рака предлагаются НЧ диоксида титана (НЧ TiO2), так как они могут выступать в качестве носителей лекарственных средств, а также потенциальных фото- или соносенсибилизаторов [2]. Последние представляют собой соединения, которые в результате их возбуждения электромагнитным излучением определенной длиной волны или активации ультразвуком генерируют образование активных форм кислорода [4]. Этот процесс может приводить к повреждениям ДНК и клеточных мембран раковых клеток, вызывая их гибель. Связывание лигандов или антител с НЧ улучшает их селективное попадание в орган или клетку, что повышает эффективность лечебного воздействия. Использование наноразмерных фотосоносенсибилизаторов легло в основу принципиально новой стратегии лечения онкологических заболеваний и представляет собой хорошую альтернативу химио- и лучевой терапии, так как сводит к минимуму побочные эффекты. Несмотря на то, что НЧ TiO2 способны легко проникать глубоко в опухолевые клетки, накапливаться там и их разрушать, они также могут оказывать токсическое действие на здоровые клетки. Те же физико-химические свойства, которые делают НЧ TiO2 перспективными для многих новых подходов лечения, одновременно с этим создают потенциальную опасность для различных органов и тканей человека. Воздействие НЧ TiO2 вызывает усиление перекисного окисления липидов, повреждение ДНК, активацию ряда каспаз с последующей гибелью клеток посредством апоптоза [11]. Рядом исследователей на различных моделях обнаружено, что НЧ провоцируют развитие пневмонии, при этом преобладающим типом клеток в легких и бронхоальвеолярном лаваже после ингаляции или интрахеальном введении НЧ являются нейтрофилы [8]. Нейтрофилы (НФ) в периферической крови человека - наиболее чувствительные к различным воздействиям и мобильные элементы системы неспецифической резистентности организма. В ходе миграции к месту инфекции и воспаления НФ непрерывно подвергаются адгезии к эндотелию сосудов, расширению и сжатию, деформации и восстановлению. Время, необходимое НФ для деформации в микрокапиллярах, имеющих меньший диаметр, чем диаметр самих НФ, определяется их реологическими свойствами. Упругие свойства нейтрофилов тесно связаны с их иммунной функцией. Поэтому исследование реологических свойств (вязкоупругих характеристик) НФ имеет решающее значение для понимания механизмов патологических изменений, инициированных ими в органах и тканях в ответ на воздействие НЧ. Тем не менее сведений о непосредственном воздействии НЧ TiO2 на нейтрофилы недостаточно. Кроме того, поскольку НЧ TiO2 уже используются в различных областях промышленности и входят в состав самых разных изделий, велика вероятность их попадания в организм и взаимодействия с иммунокомпетентными клетками. Современные автоматизированные методы оценки морфофункционального статуса клеток организма в подавляющем большинстве случаев предполагают фиксацию и применение реактивов для выявления объектов. Одним из перспективных методов для изучения клеток является атомно-силовая микроскопия (AСM). Она является мощным инструментом в различных биомедицинских исследованиях, поскольку позволяет комплексно рассмотреть структурные и вязкоупругие особенности любых клеток, включая нейтрофилы, без использования жестких методов фиксации и, тем самым, сводя к минимуму повреждение клеток. С помощью АСМ изучены адгезионные и механические характеристики клеток крови при различных патологиях [1, 7, 15]. Однако о том, как изменяются характеристики нейтрофилов при прямом воздействии на них НЧ TiO2, пока не известно. Цель настоящего исследования - изучение структурно-биомеханических характеристик нейтрофилов крови на фоне воздействия наночастиц диоксида титана с помощью высокоразрешающей АСМ. Материал и методы. Были изучены НФ, полученные из крови 20 условно здоровых доноров обоего пола в возрасте 20-22 лет. Структурно-биомеханические характеристики НФ оценивали в эксперименте до и после воздействия НЧ TiO2. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН (протокол № 2 от 25.04.2016 г.). Для выполнения работы было получено добровольное информированное согласие пациентов на участие в проведенном исследовании. В работе использовали дисперсию диоксида титана (рутильная форма), полученную разведением порошка TiO2 в дистиллированной воде. Конечная концентрация TiO2 составила 0,75 мг/мл. Агрегацию наночастиц предотвращали обработкой суспензии нанодисперсного TiO2 в ультразвуковой ванне. Распределение частиц TiO2 по размерам определяли на анализаторе размеров частиц Shimadzu SALD-7101 (Shimadzu, Япония): спектральное разрешение 1 нм, диапазон от 10 нм до 300 мкм, метод - лазерная дифракция с применением УФ-лазера (Shimadzu, Япония) с длиной волны излучения 375 нм. Средний размер НЧ TiO2 составил 40-60 нм. НФ выделяли по методу И. С. Подосинникова и соавт. (1981) из гепаринизированной (20 ЕД/мл) венозной крови по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-урографина. После центрифугирования кольцо НФ собирали с помощью пипетки Пастера и разбавляли равным объемом забуференного раствора NaCl (0,45 %). Для поддержания нормальной осмолярности клетки дважды суспендировали в фосфатно-солевом буфере PBS, центрифугировали в течение 10 мин и снова суспендировали в солевом растворе Хенкса (HBSS). Жизнеспособность клеток по тесту с трипановым синим составила 95-100 %. НФ (2·106 клеток/мл) инкубировали с НЧ TiO2 (0,75 мг/мл) в течение 30 мин при 37 ºС. Для измерения морфометрических параметров НФ контрольной группы (интактные) и НФ, подвергнутые воздействию НЧ TiO2 (опытная группа), фиксировали на твердой подложке (стекло) с использованием глутарового альдегида (1,5 %). Сканирование поверхности от 10 до 12 клеток каждого образца крови проводили в полуконтактном режиме на воздухе, используя кремниевые зонды PPP-CONTPt (Nanosensors, Switzerland) с жесткостью 43 Н/м и резонансной частотой 185 кГц. Для визуализации сканируемых объектов использовали программу PicoView 1.20. Из полученных топографий поверхностей НФ были сформированы их трехмерные изображения, на которых четко выявлялись контуры ядра и цитоплазмы. Для оценки морфометрических параметров и структурных особенностей клеточной поверхности НФ были построены кривые профилей сечения поверхности, на которых определяли диаметр и высоту клетки относительно подложки (мкм). Для оценки степени шероховатости была определена глубина инвагинации (мкм) путем вычисления разности между минимальной и максимальной высотой клетки относительно подложки. Исследование упругих свойств поверхности НФ производили на АСМ в режиме силовой спектроскопии. Для этого снимали кривые подвода зонда к поверхности («силовые кривые»), демонстрирующие зависимость величины изгиба балки, а следовательно, и силы взаимодействия зонда с поверхностью, от расстояния сближения зонда и образца. Исследования поверхности нативных клеток интактной и опытной групп проводили в жидкостной ячейке при комнатной температуре на АСМ Agilent 5500AFM с использованием кремниевых зондов PPP-CONTPt (Nanosensors, Switzerland) и коллоидных V-образных зондов CP-PNPL-SiO-C (Nanosensors, Switzerland) с прикрепленной сферой (диаметр 6,62 мкм). Для оценки упругих свойств НФ определяли эффективный модуль Юнга в рамках принятой модели контактной механики Герца. Все измерения исследуемых клеток проводили в течение 1 ч. В серии экспериментов сравнивали показатели упругости НФ, полученных из крови доноров до и после воздействия НЧ TiO2. Для этого проводили обзорное сканирование поля размером 60×60 мкм и выбирали для измерения не менее 10-15 клеток. Статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatsoftInc, США). Статистическая обработка данных включала вычисление среднеарифметического значения и его стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при р<0,05. Результаты исследования. В контрольных образцах крови присутствовали НФ округлой формы с ровными краями, преимущественно имеющие сегментированное ядро, расположенное асимметрично (рис. 1). Поверхность НФ имела незначительные инвагинации. НФ, подвергнутые воздействию НЧ, имели неровные контуры, просматривались псевдоподии (рис. 2, а). Результаты оценки морфометрических показателей представлены в таблице, из данных которой видно, что средний диаметр клеток на фоне НЧ TiО2 незначительно уменьшался (p>0,05). Воздействие НЧ TiО2 вызывало увеличение средней высоты клеток (р<0,05). Наглядно средняя высота клеток продемонстрирована на кривой бокового профиля клеток (см. рис. 1, в). При сравнении степени шероховатости поверхности оказалось, что минимальная и максимальная высоты интактных НФ были значительно больше, чем у НФ опытной группы. Максимальный перепад высот был выше у НФ на фоне воздействия НЧ TiО2, что указывает на то, что поверхность клеток опытной группы отличалась большей шероховатостью по сравнению с интактными НФ, при этом топография поверхности клетки имела «пенистый» вид (см. рис. 2, а). При изучении биомеханических свойств (жесткости) поверхности НФ было установлено, что присутствие НЧ TiO2 ведет к увеличению ригидности поверхности НФ на 121 % (p<0,05) по сравнению с контролем. Результаты силовой спектроскопии представлены на рис. 3. На графике изображены две кривые подвода зонда к поверхности НФ. Отчетливо видно, что силовая кривая НФ в опытной группе имеет более крутой наклон, что свидетельствует о том, что жесткость клеток значительно выше, чем у интактных НФ. Обсуждение полученных данных. Исследования показали, что НФ в периферической крови после воздействия НЧ TiO2 претерпевают структурные преобразования, заключающиеся в уменьшении диаметра клетки, увеличении ее высоты и степени шероховатости поверхности. Сложилось представление о том, что уровень функциональной активности клетки связан с такими характеристиками ядра, как его величина и площадь. Поскольку высота ядра определяется конформационным состоянием ядерных белков и степенью деконденсации хроматина, то изменение этого параметра в сторону увеличения косвенно может свидетельствовать об уменьшении функциональной активности клетки либо об угасании синтетических процессов в клетке. В своей работе мы оценивали величину высоты клетки, которая коррелирует с размерами ядра НФ. Обнаруженное нами увеличение высоты клеток, расположенных на подложке, указывает на снижение их функциональной активности по сравнению с интактными НФ, что, по-видимому, вызвано воздействием НЧ TiO2. Это хорошо согласуется с результатами, полученными M. Horie и соавт. [5], которые на другой модели обнаружили, что НЧ TiO2 вызывают снижение жизнеспособности и пролиферации кератиноцитов человека. Результаты наших исследований показали, что, наряду с изменением морфометрических параметров клеток на фоне воздействия НЧ TiO2, происходит и изменение особенностей поверхности НФ, и в частности увеличение степени их шероховатости. АСМ-сканирование клеток выявило, что на поверхности НФ, обработанных НЧ TiO2, определяются многочисленные инвагинации. Визуальный анализ был подтвержден и измерениями максимальной глубины инвагинаций. Известно, что при осуществлении фагоцитоза происходит плотный контакт между клеткой и фагоцитируемым материалом с формированием эндосомы, что меняет топографию поверхности НФ, приводя к появлению инвагинаций. Результаты наших исследований согласуются с имеющимися в литературе данными об увеличении степени механической неоднородности поверхности НФ в результате воздействия НЧ. Так, в экспериментах с НЧ Fe3O4 было показано, что размер инвагинаций напрямую зависит от размера частиц и является следствием повышения фагоцитарной активности клетки [6]. Эта обратная зависимость размера частиц от фагоцитарной активности продемонстрирована и на других НЧ (оксида железа, серебра и золота), а также подтверждена биохимическими исследованиями, свидетельствующими об увеличении концентрации лизосомальных ферментов в ответ на воздействие НЧ. По мнению некоторых авторов, увеличение шероховатости НФ является маркером их фагоцитарной активности [12]. Исследования, посвященные изучению строения (средняя высота, диаметр клетки), а также биофизических (шероховатость) и биомеханических (жесткость) свойств других клеток до и после воздействия НЧ малочисленны. Однако известно, что НЧ серебра повышают шероховатость и высоту альвеолярных эпителиальных клеток, фибробластов, а НЧ диоксида кремния взаимодействуют с мембраной мезенхимных стволовых клеток, вызывая их структурные изменения [10]. Проведенное нами исследование упругих свойств поверхности НФ свидетельствует о том, что расчетные показатели значения их жесткости сопоставимы с показателями таких клеток человека, как фибробласты, лимфоциты, мезенхимальные стволовые клетки, остеобласты и эндотелиальные клетки. Показано, что механические свойства мембраны НФ после воздействия НЧ TiO2 изменяются, а именно, модуль упругости клеток значительно повышается, что свидетельствует об увеличении жесткости НФ. Механизм таких изменений до сих пор остается неясным. Предполагается, что это может быть связано со структурной реорганизацией сократительных белков цитоскелета, в частности с изменением соотношения F-актина/G-актина [15]. Другой возможной причиной повышения жесткости поверхности НФ является усиленная генерация активных форм кислорода на фоне воздействия НЧ, которая может способствовать окислительным модификациям собственных клеточных компонентов. Увеличение окислительного стресса приводит к повышению микровязкости поверхностных мембран лейкоцитов крови, указывающему на приобретение мембранами клеток менее пластичных свойств. В последнее время появились много работ, свидетельствующих о том, что биофизические свойства ряда клеток крови могут служить диагностическим критерием различных патологий. Так, при исследовании механических свойств НФ у людей с хронической обструктивной болезнью легких выявлено, что жесткость мембраны НФ значительно выше, чем у здоровых некурящих людей [1, 13]. При изучении пойкилоцитов у пациентов с наследственными сфероцитозом, талассемией и анизоцитозом I. Dulinska и соавт. [3] установлено, что жесткость клеток была значительно выше по сравнению с нормальными клетками. M. Lekka и соавт. [7] сравнивали жесткость эритроцитов у пациентов с ишемической болезнью, гипертонией, сахарным диабетом, обнаружив увеличение модуля Юнга в клетках у этой категории больных. Механические свойства НФ и те изменения, которые сопровождают их во время активации, играют ключевую роль в определении их реакции на воспалительные раздражители. Действительно, возрастание жесткости НФ приводит к уменьшению скорости движения, задержке и агрегации в микрокапиллярах, последующей их адгезии к эндотелию в крупных кровеносных сосудах, снижению миграции в участок воспаления и, тем самым, ослаблению противоинфекционной защиты. В свете этих представлений возрастает диагностическая ценность показателей нарушения подвижности НФ крови, а знание их реологии необходимо для лучшего понимания патофизиологических последствий изменения механических характеристик НФ. Таким образом, обнаруженные изменения биофизических свойств поверхности НФ в результате взаимодействия с НЧ могут служить одним из самых ранних маркеров их цитотоксического действия. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. В. В. Сбор и обработка материала: Л. А. Ш., Ю. С. З. Статистическая обработка данных: Л. А. Ш., М. Р. Д. Анализ и интерпретация данных: Л. А. Ш., З. Р. Х., В. В. В. Написание текста: Л. А. Ш., В. В. В. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Люция Ахтямовна Шарафутдинова

Башкирский государственный университет

Email: sharafla@yandex.ru
кафедра физиологии и общей биологии биологического факультета 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32

Юрий Сергеевич Замула

Башкирский государственный университет

лаборатория экспериментальных исследований, Центр микронаномасштабной динамики дисперсных систем 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32

Зухра Рашидовна Хисматуллина

Башкирский государственный университет

кафедра физиологии и общей биологии биологического факультета 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32

Марсель Раилевич Даминов

Башкирский государственный университет

кафедра физиологии и общей биологии биологического факультета 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32

Виктор Владимирович Валиуллин

Казанский государственный медицинский университет

кафедра гистологии 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49

Список литературы

Дополнительные файлы