СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПРЕССИИ ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ В ГИППОКАМПЕ ЧЕЛОВЕКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Полный текст

Гиппокамп является важным звеном лимбической системы, участвующим в регуляции полового и эмоционального поведения, а также в процессах обучения и сохранения памяти. Интерес представляет изучение изменения нейронов при различных патологических состояниях, а также при стрессовых ситуациях, приводящих к патологическим изменениям в сердечно-сосудистой системе [2]. Иммуногистохимические биомаркеры, позволяющие визуализировать изменения в нервной ткани, дают возможность изучать нервную ткань на клеточном и субклеточном уровнях. Одним из них является индуцибельная NO-синтаза (iNOS), позволяющая обнаружить изменения в головном мозгу при гипоксии. Сверхактивация iNOS и чрезмерное образование NO при ишемии и гипоксии головного мозга свидетельствуют о запуске каскада реакций перекисного окисления, что приводит к повреждению нервной ткани и последующим нейродегенеративным изменениям. iNOS является ключевым фактором в регуляции мозгового кровотока и реакций воспаления [4]. Целью исследования явилось изучение особенностей экспрессии индуцибельной NO-cинтазы в полях СА1 и СА3 гиппокампа у лиц мужского пола второго периода зрелого возраста в условиях стеноза средней мозговой артерии более чем на 50 % и у крыс в возрасте 12 мес при комбинированном стрессе. Материал и методы. Исследование проводилось на аутопсийном и экспериментальном материалах. В работе использовали гиппокампы мозга мужчин, относящихся ко второму периоду зрелого возраста (10 наблюдений), у которых был выявлен стеноз средней мозговой артерии (СМА) более чем на 50 %, имеющих в анамнезе ишемическую болезнь сердца. Причиной их смерти был острый инфаркт миокарда, который рассматривался как болевой стресс. В группу сравнения включены гиппокампы мужчин (10 наблюдений), причина смерти которых не была связана с патологией сердечно-сосудистой системы. Аутопсийный материал получали из ГБУЗ Волгоградского областного патологоанатомического бюро и Волгоградского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. При работе с секционным материалом были учтены требования Федерального закона от 12.01.1996 г. № 8-ФЗ (ред. от 03.07.2016 г., с изм. от 19.12.2016 г.) «О погребении и похоронном деле» (с изм. и доп., вступ. в силу с 01.01.2017 г.). Экспериментальный материал включал головной мозг нелинейных белых крыс-самцов в возрасте 12 мес (20 особей). Животные были разделены на две равные группы - контрольные крысы и крысы, подвергшиеся комбинированному стрессорному воздействию (пульсирующий свет, громкий звук, вибрация) [1]. Эвтаназию проводили с использованием «Гильотины для крыс» AE0702 (Open Science, Россия). При содержании животных, моделировании комбинированного стресса, а также выведении их из эксперимента руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларацией (1975 г., 2000 г.). Дизайн исследования был согласован и одобрен Региональным независимым этическим комитетом (протокол № 96-2009 от 03.04.2009 г., протокол № 207-2014 от 25.12.2014 г.). Материал фиксировали в нейтральном забуференном 10 % формалине. Для иммуногистохимического исследования изготовленные парафиновые срезы толщиной 4 мкм подвергали депарафинизации. Экспрессию iNOS определяли иммуногистохимическим методом по классической схеме с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA, США). В качестве первичных антител использовали поликлональные кроличьи антитела того же производителя (разведение 1:100). В качестве хромогена был использован диаминобензидин. Оценку изменений уровня экспрессии iNOS определяли путём подсчёта относительной площади иммунореактивного материала (ИРМ) в полях СА1 и СА3 гиппокампа с использованием модуля Image Analysis программы ZEN 1.1.2.0, а также интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3. Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа «Axio Lab. A1», фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color» (все вышеперечисленные приборы - Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6.0. Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала (Q1-Q3), где Q1 - 25-й процентиль, Q3 - 75-й процентиль. Различия между группами оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты исследования. В гиппокампе мужчин зрелого возраста при изучении полей СА1 и СА3 в цитоплазме нейронов пирамидного слоя и дендритах радиального слоя наблюдалась умеренно выраженная гранулярная экспрессия iNOS-ИРМ (2 балла), встречались единичные нейроны с выраженной цитоплазматической экспрессией iNOS-ИРМ, окружающий нейропиль характеризовался слабовыраженной экспрессией (1 балл) (рис. 1). Напротив, в гиппокампе лиц со стенозом СМА в цитоплазме перикарионов нейронов пирамидного слоя поля СА1 в отличие от группы сравнения отмечалась выраженная степень экспрессии iNOS-ИРМ (3 балла). Окружающий нейропиль характеризовался умеренной степенью экспрессии ИРМ (2 балла) как в поле СА1, так и в поле СА3 (см. рис. 1). При морфометрическом исследовании отмечалось увеличение относительной площади iNOS-ИРМ: в поле СА1 - на 12,5 % (р<0,05), в поле СА3 - на 18,6 % (р<0,05). Оно составило 20,5 (19,0-22,7) % и 28,1 (26,1-31,7) % соответственно по сравнению с контрольной группой. При иммуногистохимическом исследовании гиппокампа крыс отмечалась слабая экспрессия (1 балл) iNOS-ИРМ в цитоплазме перикарионов нейронов пирамидного слоя полей СА1 и СА3, встречались единичные нейроциты с умеренно выраженной цитоплазматической экспрессией ИРМ (2 балла). В нейропиле радиального слоя поля СА1 была обнаружена слабовыраженная гранулярная экспрессия iNOS-ИРМ (1 балл), в поле СА3 -умеренно выраженная экспрессия (2 балла). В гиппокампе стрессированных крыс в отличие от контрольной группы животных отмечалось увеличение цитоплазматической степени экспрессии iNOS-ИРМ в перикарионах нейронов пирамидного слоя (2 балла) полей СА1 и СА3. Обнаруживались единичные нейроны с выраженной степенью экспрессии iNOS-ИРМ. В нейропиле радиального слоя поля СА3 наблюдалась умеренно выраженная степень экспрессии ИРМ (2 балла) (рис. 2). Относительная площадь ИРМ в поле СА1 у контрольной группы животных составила 3,9 (2,2-11,3) %, у стрессированных крыс - 6,6 (5,5-9,6) % (p>0,05). Относительная площадь ИРМ в поле СА3 гиппокампа у стрессированных крыс увеличилась на 30,2 % (р<0,05), что составило 53,5 (46,4-57,1) %. Обсуждение полученных данных. Учитывая, что значительное повышение iNOS [4] ведет к образованию не только NO, но и его метаболитов - пероксинитритов, запускающих каскад окислительных реакций, обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии iNOS в полях СА1 и СА3 гиппокампа как у лиц мужского пола второго периода зрелого возраста со стенозом СМА более 50 %, так и у экспериментальных животных зрелого возраста, может свидетельствовать о схожих механизмах iNOS-опосредованного повреждения нейронов пирамидного слоя гиппокампа у человека и экспериментальных животных при стрессовых состояниях. Таким образом, наиболее выраженные повреждения нейронов и увеличение уровня экспрессии iNOS были выявлены в пирамидном слое в поле СА3 гиппокампа у лиц мужского пола второго периода зрелого возраста со стенозом СМА более 50 % и животных зрелого возраста, перенесших стресс. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: А. В. С., А. И. К., Н. В. Г. Сбор и обработка материала: Е. В. Г., М. Р. Э. Статистическая обработка данных: Е. В. Г., М. Р. Э. Анализ и интерпретация данных: Е. В. Г., М. Р. Э., Д. Ю. Г., Т. А. Б. Написание текста: Е. В. Г., М. Р. Э., А. В. С. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Елена Владимировна Горелик

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: gorelikvolgmu14@yandex.ru
Кафедра патологической анатомии; кафедра анатомии человека 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Мария Рафаэлевна Экова

Волгоградский государственный медицинский университет

Кафедра патологической анатомии 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Алексей Владимирович Смирнов

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Кафедра патологической анатомии; лаборатория морфологии, иммуногистохимии и канцерогенеза 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Наталья Владимировна Григорьева

Волгоградский государственный медицинский университет

Кафедра патологической анатомии 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Александр Иванович Краюшкин

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра анатомии человека 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Дмитрий Юрьевич Гуров

Волгоградский государственный медицинский университет

Кафедра патологической анатомии 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Татьяна Анатольевна Белик

Волгоградский государственный медицинский университет

Кафедра патологической анатомии 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Список литературы

Дополнительные файлы