NeuN NUCLEAR PROTEIN IN NEURONS OF HUMAN BRAIN SUBSTANTIA NIGRA

详细

The expression of NeuN protein was examined immunocytochemically in the neurons of human substantia nigra (n=14, age: 27–78 years). Some of substantia nigra neurons demonstrated weak NeuN immunopositive reaction, while the others were NeuN-immunonegative. In general, NeuN immunocytochemical reaction in neurons of human substantia nigra was expressed much weaker than in the nucleus rubrum neurons located in the same sections.

全文:

Известно, что ядерный белок NeuN локализуется в ядрах и перинуклеарной цитоплазме большинства нейронов ЦНС млекопитающих [6]. Вместе с тем, определены ряд типов нейронов, в ядрах которых, по неизвестной пока причине, этот белок не обнаружен. Так, к нейронам, в норме не синтезирующим NeuN, относятся клетки Кахаля—Ретциуса в неокортексе, многие клетки мозжечка (клетки Пуркинье, корзинчатые и звездчатые клетки, клетки Гольджи, униполярные щетинковые нейроны, клетки Лугаро, нейроны зубчатого ядра), нейроны нижних олив, митральные клетки обонятельных луковиц, гаммамотонейроны в спинном мозге [2]. Данные об особенностях экспрессии NeuN в нейронах черного вещества (ЧВ) у лабораторных млекопитающих противоречивы [4, 5], а в отношении человека — отсутствуют. Учитывая то, что при различных патологических состояниях белок NeuN в нейронах перестает синтезироваться [2], сведения о его экспрессии в клетках ЧВ могут быть существенны для оценки функционального статуса этого важнейшего дофаминергического центра [3]. Цель данного исследования состояла в иммуногистохимическом выявлении белка NeuN в нейронах ЧВ головного мозга человека. Материал и методы. В работе использованы фрагменты стволового отдела головного мозга людей обоего пола (n=14, возраст 27–78 лет), полученные при аутопсии. Программа исследования имеет положительное заключение этического комитета Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Готовили срезы толщиной 5 мкм. Белок NeuN выявляли с помощью моноклональных (клон А60) мышиных антител (Chemicon, США) и набора EnVision+® System Labelled Polymer-HRP Anti-Mouse (Dako, Дания). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). Часть срезов докрашивали астровым синим. В качестве внутреннего положительного контроля выступали нейроны красного ядра, расположенного на тех же срезах. Анализ и фотосъемку препаратов выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Результаты исследования. Обнаружено, что в изученных препаратах реакцию на белок NeuN давали только нейроны. В нейропиле положительная реакция на этот белок отсутствовала. Большинство нейронов ЧВ отчетливо определялись на не докрашенных срезах благодаря наличию в их цитоплазме нейромеланина. Кроме того, на докрашенных срезах среди нейронов ЧВ выявлялись и те, которые не содержали нейромеланина. Во всех исследованных случаях в ЧВ встречались несколько вариантов нейронов, различающихся по содержанию нейромеланина и способности окрашиваться при проведении реакции на белок NeuN: нейроны, содержащие нейромеланин и белок NeuN, нейроны, содержащие нейромеланин, но не дающие реакции на белок NeuN, и нейроны, не содержащие нейромеланина, но дающие реакцию на белок NeuN (рисунок, а–в). Общим признаком иммунопозитивных ядер нейронов ЧВ была слабая реакция на белок NeuN. В отличие от нейронов ЧВ, в нейронах красного ядра реакция на белок NeuN была интенсивная, причем в большинстве случаев наблюдалось окрашивание не только ядер клеток, но и перинуклеарной цитоплазмы (см. рисунок, г). Обсуждение полученных данных. Как было установлено ранее [1], в ЧВ головного мозга человека присутствуют нейроны как содержащие нейромеланин, так и лишенные его. Настоящее исследование показало, что белок NeuN выявляется и в тех, и в других подтипах нейронов ЧВ, однако его концентрация в них значительно ниже, чем в нейронах анатомически близко расположенного к ЧВ красного ядра и других областей головного мозга [6]. Этот факт может быть обусловлен специфическими функциональными характеристиками дофаминергических нейронов головного мозга, связанными с биосинтезом нейромеланина и метаболизмом катехоламинов [3]. Ранее, при исследовании распределения белка NeuN в клетках ЧВ головного мозга крысы было обнаружено, что в части нейронов он слабо экспрессируется, а в части — отсутствует [4]. В то же время, у песчанок NeuN-иммунопозитивные нейроны были выявлены только в компактной части ЧВ [5]. Результаты этого исследования сопоставимы с данными, полученными при изучении экспрессии белка NeuN в нейронах ЧВ крысы: популяция нейронов ЧВ у человека также неоднородна, поскольку в ней имеются клетки, в которых белок NeuN выявляется и в которых он отсутствует. Негативный результат иммуноцитохимической реакции в части нейронов ЧВ может объясняться тем, что белок NeuN в них либо не экспрессируется совсем, либо он экспрессируется в таком малом количестве, что методами иммуноцитохимии не определяется. Таким образом, нейроны ЧВ головного мозга человека по выявляемости белка NeuN подразделяются на 2 группы: слабо иммунопозитивные и иммунонегативные к этому белку. Установленный факт следует учитывать при изучении патогенеза болезни Паркинсона и создании ее адекватных экспериментальных моделей.