НАНОЧАСТИЦЫ МЕДИ — МОДУЛЯТОРЫ АПОПТОЗА И СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В НЕКОТОРЫХ ОРГАНАХ



Цитировать

Полный текст

Аннотация

На 78 крысах-самцах линии Вистар проведено изучение влияния многократного внутримышечного введения в организм наночастиц меди (НЧМ) диаметром 103 нм на показатель готовности клеток к апоптозу и структуру печени, селезенки, почек и сенсомоторной зоны коры большого мозга. Введение НЧМ проводили 1 раз в неделю на протяжении 12 нед. Изучаемые органы исследовали с использованием гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов. Установлено, что НЧМ распределяются по органам и тканям животных, вызывая специфические для каждой ткани структурные изменения. Токсичность по отношению к микроглиоцитам НЧМ проявляют в дозе 2 мг/кг, гепатотоксичность и нефротоксичность — 6 мг/кг. Увеличение нагрузки НЧМ на организм, вплоть до порогов токсического действия (максимально переносимой дозы), приводит к появлению признаков дистрофии и некроза тканей. Полученные данные позволяют предложить в качестве критерия для оценки безопасности введения НЧМ в организм — показатель готовности клеток к апоптозу, определенные по экспрессии каспазы-3.

Полный текст

В литературе описаны как позитивные, так и негативные эффекты контакта наноматериалов и живых систем. Так, созданы повязки с кристаллическим серебром для лечения ран, ожогов, трофических язв [17]. Различия влияния солей металлов и наночастиц металлов на биологические объекты связаны с особенностями их физико-химических и биологических свойств: токсичность наночастиц металлов в 7–50 раз меньше, чем солей, они оказывают полифункциональное и пролонгированное действие, легко проникают во все органы и ткани, в биотических дозах стимулируют обменные процессы и т. д. [3, 7, 9, 11]. В то же время, наночастицы могут оказывать на живые системы патологическое действие и приводить к гибели, например, изменения в легких при внутритрахеальной затравке наноуглеродными трубками, формирование отёка мозга и нарушение функции гематоэнцефалического барьера при действии наночастиц серебра, меди, алюминия, кремния, углерода и металлических оксидов [13, 16, 18]. Изучены степень повреждения ДНК и токсичность наночастиц оксидов различных металлов [12, 15]. В то же время, отсутствуют сведения об изменении структурно-функционального состояния тканей животных при увеличении нагрузки металлами в виде наночастиц на организм, отсутствуют критерии, по которым можно решить вопрос о безопасности введения данного наноматериала. В связи с этим целью настоящей работы было исследование изменения показателя апоптоза и структуры тканей при увеличении нагрузки наночастицами меди (НЧМ) на организм. Материал и методы. Исследования проведены в условиях экспериментально-биологической клиники Оренбургского государственного университета на 78 (39 подопытных и 39 контрольных) белых крысах-самцах линии Вистар массой 150–180 г, находившихся в стандартных условиях вивария на естественном для грызунов корме, которым 1 раз в неделю на протяжении 12 нед вводили (всего 12 инъекций) в бедренную группу мышц суспензию НЧМ в дозе 2,0 мг/кг массы животного. Экспериментальные исследования проводили в соответствии с инструкциями, рекомендуемыми Российским Регламентом, 1987 г. и «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D. C. 1996)». НЧМ получали методом высокотемпературной конденсации с последующей модификацией кислородом на установке Миген-3 (ИХФ РАН им. Н. Н. Семенова, Россия) [4]. Средний размер НЧМ составляет 103,0±2,0 нм; кристаллической меди в ядре частиц содержится 96±4%, меди оксида — 4,0±0,4%; толщина оксидной пленки на поверхности наночастиц — 6 нм [1]. Диспергирование нанопорошка меди проводили в изотоническом растворе на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (Укрросприбор, Украина) в режиме: 3-кратное диспергирование по 1 мин с перерывом 3 мин. Животных декапитировали под нембуталовым наркозом по следующей схеме: через 3 ч, 1, 3, 7 сут после каждой инъекции. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду и умерщвляли в те же сроки. На каждую временную точку в опыте и контроле приходилось по 3 животных. Фармакотоксическая зона модифицированных НЧМ начинается с максимально переносимой (МПД) дозы 10 мг/кг, LD50 составляет 15 мг/кг, LD100 — 30 мг/кг массы животного [1, 9]. Учитывая эти данные, для изучения структурнофункционального статуса органов и тканей животных при увеличении на организм нагрузки НЧМ, была взята однократная доза введения 2 мг/кг массы животного, позволяющая при 5-кратном введении НЧМ достичь МПД — 10 мг/кг массы животного, при 12-кратном введении — дозы, близкой к LD100 — 24 мг/кг массы животного. Для световой микроскопии и иммуногистохимического исследования селезенку, печень, почки, кору большого мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине. Парафиновые срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином Майера — эозином. При помощи окулярной точечной сеткивставки в селезенке определяли объемную плотность белой пульпы, герминативных центров, периартериальных лимфоидных муфт. Готовность клеток различных тканей к апоптозу при увеличении на организм нагрузки НЧМ оценивали по экспрессии каспазы-3. Иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах, используя моноклональные антитела (к каспазе-3) и систему визуализации (Bio Genex Super Sensitive Detection System, США. Определяли долю иммунопозитивных клеток из 1000 гепатоцитов, эпителиоцитов проксимальных канальцев почек, клеток белой пульпы селезенки и выражали в промилле. Количество глиоцитов, экспрессирующих каспазу-3, в коре большого мозга подсчитывали на условной единице площади среза. Для выявления НЧМ в исследуемых органах был применён метод с солянокислым бензидином и тиоцианатом аммония [8]. Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием пакета программ «Statistica 5.5 for Windows» и программного пакета «MS Excel 2000». Значимость различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при P≤0,05. Результаты исследования. После введения в мышцу НЧМ в дозе 2,0 мг/кг массы тела они в мышце не выявлялись, что связано с быстрым их проникновением в сосуды. При исследовании печени через 3 ч после однократного внутримышечного введения НЧМ они были видны в васкулярной части перипортальных гепатоцитов и в цитоплазме звездчатых макрофагов. Через 3 сут после введения НЧМ исчезали. В перипортальных гепатоцитах появлялись признаки гидропической дистрофии, которая не выявлялась при исследовании органа через 7 сут после однократного введения наночастиц металла. При повторном через 1 нед внутримышечном введении НЧМ последние выявлялись, преимущественно, в васкулярной части перипортальных гепатоцитов. При этом через 1 сут после 2-й инъекции наночастиц металла в васкулярной части перипортальных гепатоцитов выявлялись признаки гидропической дистрофии и тельца Каунсильмена (рис. 1, а). При исследовании структурной организации селезенки в ответ на увеличение на организм нагрузки медью было установлено, что ее наночастицы обнаруживались в красной пульпе, преимущественно в макрофагах, в 1-е сутки после внутримышечного введения металла и сохранялись в них после последующих введений. Однократное введение НЧМ не нарушало структуру селезенки, но способствовало умеренному повышению функциональной активности белой пульпы, о чем свидетельствовало повышение ее объемной плотности, а также объемной плотности герминативных центров, периартериальных лимфоидных муфт и увеличение численности клеток на условной единице площади среза в этих зонах. Морфометрические показатели белой пульпы после 2 и 3 инъекций НЧМ также свидетельствовали о повышении ее функциональной активности. Более значимые изменения морфометрических показателей белой пульпы наблюдались на 7-е сутки после повторного введения НЧМ. Увеличение объёмной плотности лимфоидных узелков после 2-го введения НЧМ происходило не только за счет герминативных центров, где происходят процессы бластной трансформации и размножения лимфоцитов, но в большинстве узелков за счет мантийной и краевой зон, где происходят процессы дифференцировки и выход клеток в красную пульпу. НЧМ были выявлены в эпителиоцитах проксимальных канальцев почек на 1-е сутки после их однократного внутримышечного введения. В клетках некоторых канальцев были обнаружены признаки гиалиново-капельной и гидропической дистрофии. Однако эти нарушения не выявлялись через 7 сут после однократного введения наночастиц. Почечные тельца не были изменены, но в интерстициальной ткани чаще, чем в контроле, встречались макрофаги, экспрессирующие каспазу-3 (рис. 2, а). После 2-йи, особенно после 3-й, инъекции НЧМ количество канальцев с явлениями белковой дистрофии увеличивалось. В канальцах обнаруживались эпителиоциты с признаками некроза, выявлялись также локальные повреждения базальной мембраны эпителия канальцев. После однократного введения НЧМ в сенсомоторной зоне коры большого мозга структурных изменений у животных подопытной группы не выявлено. Метод окраски с бензидином не дал положительного результата, вероятно, из-за малого количества наночастиц, поступивших в тканевые элементы мозга. В печени у контрольных животных экспрессия каспазы-3 была обнаружена только в центролобулярных гепатоцитах (таблица). После повторного введения НЧМ клетки, содержащие каспазу-3, встречались и среди перипортальных гепатоцитов (см. рис. 1, б). Различие показателей экспрессии маркеров готовности гепатоцитов к апоптозу значимо увеличивалось по сравнению с контролем через 3 и 7 сут после 3-кратного введения НЧМ — через 7 сут в 2 раза (см. таблицу). При иммуногистохимическом исследовании селезенки было выявлено, что на 7-е сутки после 12-й инъекции доля клеток, экспрессирующих каспазу-3 в лимфоидных узелках, достигала максимума, что свидетельствовало о повышении их готовности к апоптозу (см. таблицу). После 3-й инъекции НЧМ значимо — в 2,5 раза (P<0,05) по сравнению с контролем (см. таблицу) — увеличивалась готовность эпителиоцитов проксимальных канальцев почек к апоптозу. Иммуногистохимическое выявление клеток, содержащих каспазу-3, в сенсомоторной зоне коры большого мозга позволило обнаружить готовность клеток к запрограммированной гибели среди микроглиоцитов. Нервных клеток, экспрессирующих каспазу-3, в разные сроки после однократного внутримышечного введения НЧМ (1-, 3-, 7-, 14-е сутки) не обнаружено. Показатель экспрессии каспазы-3 микроглиоцитами через 1 и 3 сут после введения НЧМ меди увеличивался незначимо по сравнению с контролем. Однако через 7 сут после однократного введения экспрессия каспазы-3 в микроглиоцитах (рис. 2, б) увеличивалась в 3 раза по сравнению с контролем, а через 14 сут — снижалась до показателей у контрольных животных (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что при внутримышечном введении НЧМ легко проникают во все органы и ткани. В зависимости от типа ткани, суммарной дозы вводимых наночастиц и времени ответа в них наблюдаются специфические структурные изменения. При увеличении нагрузки НЧМ (суммарные дозы 4 и 6 мг/кг массы животных) в исследованных тканях были обнаружены явления дистрофии и некроза. На фоне структурной реорганизации тканей при действии НЧМ происходят изменения показателя готовности клеток к апоптозу, так как микроэлементы способны модулировать апоптоз, т. е. по-разному влиять в зависимости от дозы [2, 5, 6]. Следовательно, при увеличении нагрузки на организм НЧМ, помимо структурной реорганизации тканей, происходит значимое усиление экспрессии каспазы-3 в микроглиоцитах коры большого мозга через 7 сут после однократного внутримышечного введения наночастиц меди (доза 2 мг/кг массы животного), в гепатоцитах — через 3, 7 сут после 3-кратного внутримышечного введения НЧМ (суммарная доза — 6 мг/кг массы животного), в эпителиоцитах проксимальных канальцев почек — через 3 ч, 1, 3, 7 сут после 3-кратного внутримышечного введения наночастиц меди (суммарная доза — 6 мг/кг массы животного), в клетках лимфоидных узелков селезенки через 3 ч, 1, 3, 7 сут после 12-кратного внутримышечного введения НЧМ (суммарная доза — 24 мг/кг массы животного). Полученные данные свидетельствуют о высокой биологической активности НЧМ при введении в организм. В сенсомоторной коре большого мозга наиболее чувствительными к действию НЧМ в дозе 2 мг/кг оказались микроглиоциты. Хотя действие на них по показателю готовности клеток к апоптозу оказалось обратимым (через 2 нед после 1-кратного введения НЧМ в дозе 2 мг/кг этот показатель не отличался от такового в контроле), однако его реализация при дальнейшем увеличении дозы вводимых наночастиц может привести к потере клеток и вызвать нейродегенеративные процессы в коре большого мозга. Подобный эффект описан при исследовании наночастиц оксида меди на модели нейробластомы мышей, генотоксический эффект которых связан с фрагментацией, метилированием ДНК и хромосомными повреждениями при концентрации в среде 400 мг/л [14]. Гепатотоксичность и нефротоксичность НЧМ проявляются в дозе 6 мг/кг. При этом, готовность к апоптозу наблюдается в припортальных гепатоцитах после 3 сут, в эпителиоцитах канальцев почек — через 3 ч после 3-кратного введения НЧМ. Наименее чувствительной к действию НЧМ оказалась селезенка: в клетках лимфоидных узелков повышается экспрессия каспазы-3 в ответ на введение НЧМ в дозе 24 мг/кг, т. е. близкой к LD100. Нами установлено, что НЧМ являются модуляторами апоптоза. Аналогичной особенностью обладают наночастицы серебра, на основе которых предложены повязки для лечения гнойных ран, трофических язв и ожогов. Благодаря этому свойству нанокристаллическое серебро сокращает воспалительную стадию заживления ран и облегчает, таким образом, течение его начального периода [7]. Кроме того, на основании проведенных исследований, очевидно, что показатель готовности клеток к апоптозу отражает начавшиеся необратимые структурные изменения независимо от специфики реакции ткани на введение НЧМ. Это дает нам основание предложить показатель апоптоза в качестве критерия для оценки безопасности введения НЧМ в организм живых систем. По этому показателю можно судить о допустимых дозах вводимого металла, об органах-мишенях, установить оптимальные и безопасные способы введения наночастиц в организм для дальнейшего использования их в составе лекарственных средств и биопрепаратов.
×

Об авторах

Елена Анатольевна Сизова

Оренбургский государственный университет

Email: Sizova.L78@yandex.ru
кафедра общей биологии 460018, Оренбург, пр. Победы, 13

Сергей Александрович Мирошников

Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства Россельхозакадемии

Email: vniims.or@mail.ru
лаборатория минерального питания

Валентина Сергеевна Полякова

Оренбургская государственная медицинская академия Росздрава

кафедра патологической анатомии 460011, Оренбург, ул. Советская, 6

Святослав Валерьевич Лебедев

Оренбургский государственный университет

Email: inst_bioellement@mail.ru
лаборатория сельскохозяйственной биоэлементологии, Институт биоэлементологии 460018, Оренбург, пр. Победы, 13

Наталья Николаевна Глущенко

Институт энергетических проблем химической физики РАН

Email: nnglu@mail.ru
лаборатория биологического воздействия наноструктур 119334, Москва, В-334, Ленинский пр., 38, корп. 2

Список литературы

  1. Богословская О. А., Сизова Е. А., Полякова В. С. и др. Изучение безопасности введения наночастиц меди с различными физико-химическими характеристиками в организм животных. Вестн. Оренбургского гос. ун-та, 2009, № 2, с. 124–127.
  2. Глущенко Н. Н., Ольховская И. П., Плетенева Т. В. и др. Биологическое действие высокодисперсных порошков металлов. М., Изв. РАН, 1989, № 3, с. 415–419.
  3. Глущенко Н. Н., Богословская О. А. и Ольховская И. П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов. Химическая физика, 2002, т. 21, № 4, с. 79–85.
  4. Жигач А. Н., Лейпунский И. О., Кусков М. Л. и др. Установка для получения и исследования физико-химических свойств наночастиц металлов. Приборы и техника эксперимента, 2000, № 6, с. 122–127.
  5. Калетина Н. И. и Калетин Г. И. Микроэлементы — биологические регуляторы. В кн.: Наука в России. М., Изд-во РАН, 2007, № 1, с. 50–54.
  6. Кудрин А. В. и Жаворонков А. А. Роль микроэлементов и кальция в регуляции апоптоза. Успехи соврем. биол., 1998, т. 118, вып. 1, с. 623–629.
  7. Патент № 2306141. Препарат, ускоряющий ранозаживление. Т. А. Байтукалов, Н. Н. Глущенко, О. А. Богословская, И. П. Ольховская, И. О. Лейпунский, А. Н. Жигач, Э. А. Шафрановский. Заявка 28.12.2005. Опубл. в БИ, 2007, № 26.
  8. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. М., Издво иностр. лит-ры, 1962.
  9. Рахметова А. А., Алексеева Т. П., Богословская О. А. и др. Ранозаживляющие свойства наночастиц меди в зависимости от их физико-химических характеристик. Российские нанотехнологии, 2010, т. 5, № 3–4, с. 102–108.
  10. Сизова Е. А., Полякова В. С. и Глущенко Н. Н. Морфофункциональная характеристика селезенки крыс при внутримышечном введении наночастиц меди. Морфология, 2010, т. 137, вып. 4, с. 173–176.
  11. Сизова Е. А., Холодилина Т. Н., Мирошников С. А. и др. К разработке критериев безопасности наночастиц металлов при введении их в организм животных. Вестн. Российской академии сельскохозяйственных наук, 2011, № 1, с. 40–42.
  12. Karlsson H. L., Cronholm P., Gustafsson J. and Möller L. Copper oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chem. Res. Toxicol., 2008, v. 21, № 9, p. 1726–1732.
  13. Lei R.,Wu G., Yang B. et al. Integrated metabolomic analysis of the nano-sized copper particle-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity in rats: a rapid in vivo screening method for nanotoxicity. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2008, v. 232, № 2, p. 292–301.
  14. Perreault F., Pedroso Melegari S., Henning da Costa C. et al. Genotoxic effects of copper oxide nanoparticles in Neuro 2A cell cultures. Sci. Total Environ., 2012, v. 441, p. 117–124.
  15. Shvedova A. A. and Kagan V. E. The role of nanotoxicology in realizing the ‘helping without harm’ paradigm of nanomedicine: lessons from studies of pulmonary effects of single-walled carbon nanotubes. J. Intern. Med., 2010, v. 267, № 1, p. 106–118.
  16. Wang J., Rahman M. F., Duhart H. M. et al. Expression changes of dopaminergic system-related genes in PC12 cells induced by manganese, silver, or copper nanoparticles. Neurotoxicology, 2009, v. 30, № 6, p. 926–933.
  17. Wright J. B., Lam K., Buret A. G. et al. Early healing events in a porcine model of contaminated wounds: effects of nanocrystalline silver on matrix metalloproteinases, cell apoptosis, and healing. Wound Repair Regen., 2002, v. 10, № 3, p. 141–151.
  18. Yang Z., Liu Z. W., Allaker P. P. et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface., 2010, Suppl. 4, p. 313–332.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 2013


Периодический печатный журнал зарегистрирован как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): № 0110212 от 08.02.1993.
Сетевое издание зарегистрировано как СМИ Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор): ЭЛ № ФС 77 - 84733 от 10.02.2023.