ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ШИШКОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У КРЫС ПРИ ЕСТЕСТВЕННОМ СВЕТОВОМ РЕЖИМЕ И КРУГЛОСУТОЧНОМ ОСВЕЩЕНИИ

Полный текст

Известно, что световой режим - один из самых сильных синхронизаторов суточных биологических ритмов у млекопитающих. Его нарушение вызывает состояние десинхроноза - рассогласования во времени физиологических процессов - и искажение периодической программы. Пусковым механизмом развития десинхроноза и дальнейшей органической патологии является нарушение ритма продукции мелатонина в шишковидной железе (ШЖ), которая обеспечивает сохранность биологических ритмов всего организма, в том числе и иммунной системы [2]. В современных условиях все большее число людей находятся в ситуациях, когда нарушается световой режим, что приводит к рассогласованию суточных биоритмов. Это перелеты через несколько часовых поясов, работа в условиях вахтовой организации труда в Сибири, Приполярных областях и на Крайнем Севере, работа в ночные смены или по «скользящему» графику. Показано, что у людей, подвергающихся действию аномального светового режима, увеличивается риск развития иммунодефицитных состояний, аллергических и онкологических заболеваний [7, 10]. Однако в настоящее время сведения о механизмах нарушений иммунитета при изменении ритма чередования светлого и темного времени суток немногочисленны и противоречивы. В связи с этим возникает необходимость исследования взаимоотношений морфофункциональных показателей ШЖ и иммунной системы в данных условиях. Цель настоящей работы - выявить комплексную реакцию ШЖ и органов иммунной системы в ответ на нарушение светового режима в эксперименте. Материал и методы. Работа проведена на самцах крыс линии Вистар в возрасте 4 мес. Одну группу (7 крыс) содержали при естественном световом режиме (ЕО), вторую (7 крыс) - при круглосуточном освещении (КО) в течение 14 сут, после чего крыс взвешивали и декапитировали под этаминаловым наркозом в утреннее время суток (с 10.00 до 12.00 ч). Для исследования брали кровь (из декапитационной раны), лимфоидные органы (тимус и селезенку), ШЖ. Органы взвешивали и вычисляли их весовые индексы по формуле: А/В, где А - масса органа, мг, В - масса тела, г. Из тимуса и селезёнки готовили клеточную суспензию, в камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток в крови и в суспензии из лимфоидных органов. Среди клеток тимуса и селезенки определяли долю и абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+8-, CD4-8+, CD4+25+, CD45RA+, CD11b/c с помощью соответствующих моноклональных антител, меченных флюоресцеин-изотиоцианатом и фикоэритрином (BD Pharmingen, США), на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Выделенные ШЖ помещали в среду для замораживания срезов NEG 50 (Thermo Microm Scientific, Германия), после чего замораживали при помощи жидкого азота. Срезы толщиной 10 мкм были приготовлены на микротоме-криостате HM 560 MV (Thermo Microm Scientific, Германия). Липофусцин в ШЖ исследовали, регистрируя и измеряя интенсивность аутофлюоресценции в криостатных срезах с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Для возбуждения аутофлюоресценции применяли аргоновый лазер (длина волны 488 нм), для измерений использовали объектив EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27. Измерение сигнала аутофлюоресценции осуществлялось в 2 канала: зеленый (длина волн от 505 до 545 нм) и красный (длина волн больше 560 нм) [11]. Конфокальная диафрагма для каждого канала была полностью открыта в связи с малой величиной интенсивности аутофлюоресценции. Для получения детальных снимков с большим увеличением использовали объектив Plan-Apochromat 100x/1,40 Oil DIC M27, конфокальная диафрагма для каждого канала была равна примерно 4,3 ед. Эйри. Все экспериментальные процедуры выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Эксперимент был проведен в зимнее время года (февраль 2013 г.). Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ для ПК «Statistica 7». Значимость различий между группами оценивали по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Проводили также корреляционный анализ с вычислением коэффициентов корреляции Спирмена. Результаты исследования. Выявлено, что при КО значимо снижаются масса ШЖ (2,2±0,4 мг при ЕО и 0,88±0,15 мг при КО, P<0,05), ее весовой индекс (0,010±0,002 при ЕО и 0,0030±0,0006 при КО, P<0,05). В ШЖ наблюдается тенденция к повышению содержания липофусцина (рис. 1) (39,2±1,2 усл. ед. в контроле и 46±4 усл. ед. при КО, P>0,05). Корреляционный анализ показал, что при ЕО между параметрами органов иммунной системы и ШЖ существует небольшое количество связей (рис. 2, а; таблица). Положительные корреляции определяются между массой ШЖ и ее весовым индексом, а также массой ШЖ и популяциями Т-лимфоцитов селезенки (CD3+, CD4+25+). Отрицательная связь была выявлена между весовым индексом ШЖ и массой тела. При КО количество корреляционных связей резко возрастает (см. рис. 2, б; таблицу). Положительные связи определяются между показателями ШЖ (количеством липофусцина, массой и весовым индексом ШЖ) и тимуса (масса, доли CD4+8+-и CD4+25+клеток). Отрицательные связи выявлены между количеством липофусцина в ШЖ и количеством популяций Т-лимфоцитов селезенки (CD4+8-, CD4+8+), а также между весовыми характеристиками ШЖ (массой и весовым индексом) и относительным содержанием субпопуляций тимоцитов (CD4-8+ и CD4-8+). Корреляционные связи между содержанием клеточных субпопуляций в лимфоидных органах и их весовыми характеристиками при ЕО представлены на рис. 3, а и в таблице. Положительные корреляционные связи обнаружены: между массой тимуса и относительным содержанием в нём CD4-8+-, CD4+8--субпопуляций, массой селезенки и относительным содержанием в органе В-лимфоцитов (CD45RA+). Отрицательная связь выявлена между массой тимуса и долей незрелых клеток в органе (CD4+8+). Корреляционные одного органа - тимуса или селезенки. Выявлена связи между численностью различных клеточных только одна межорганная положительная связь субпопуляций наблюдаются в основном внутри между абсолютным числом CD4-8+-тимоцитов и CD11b/c+-лимфоцитов селезенки. При КО количество, знак и направленность связей между показателями клеточного состава лимфоидных органов меняются, при этом увеличивается количество межорганных корреляционных связей между клеточным составом тимуса и селезенки (см. рис. 3, б; таблицу). Обсуждение полученных данных. Ранее было показано, что КО оказывает влияние на состояние иммунной системы - нарушает суточные ритмы клеточного состава лимфоидных органов, процессы пролиферации и центральной дифференцировки Т-лимфоцитов [5, 6]. Однако для характеристики состояния мультипараметричных систем, в том числе нейроиммуноэндокринной системы, имеют значение не только и не столько величины отдельных параметров, сколько их взаимоотношения между собой. Поэтому с целью получения более полной информации об иммунобиологических эффектах КО мы использовали основные положения концепции «мобилей», рассматривающей нейроэндокринно-иммунный гомеостаз как сложную систему компонентов, работающую во взаимосвязи всех ее составляющих, в которой напряженность функционирования определяется количеством и силой связей между отдельными параметрами [3]. Из результатов анализа корреляционных связей между массой лимфоидных органов и их клеточным составом можно сделать заключение, что при ЕО масса тимуса формируется за счет дифференцированных субпопуляций Т-лимфоцитов, а масса селезенки - за счет В-лимфоцитарной популяции. При КО масса селезенки связана только с численностью Т-лимфоцитов, что согласуется с полученными ранее данными о снижении содержания В-лимфоцитов в селезенке крыс под влиянием КО [6]. Вероятно, это связано с нарушением суточного ритма продукции кортикостерона [12] в условиях блокады синтеза мелатонина КО, что может вызвать изменения интенсивности и направленности миграции лимфоцитов из кровеносного русла в лимфоидные органы и ткани, в частности в селезенку [8]. Обнаружено, что изменение светового режима оказывает влияние на процессы центрального Т-лимфопоэза. При ЕО выявлена отрицательная связь между относительным содержанием в тимусе CD4+8+-незрелых тимоцитов и CD4-8+ лимфоцитов (зрелые эффекторы/киллеры), что позволяет предполагать направление дифференцировки тимоцитов в сторону данной субпопуляции. При КО отрицательная корреляционная связь наблюдается между относительным содержанием CD4+8+-и CD4+8--тимоцитов, т. е. в этих условиях меняется направление дифференцировки тимоцитов в строну субпопуляции хелперовиндукторов. Увеличение количества связей между субпопуляциями клеток тимуса и селезёнки при КО свидетельствует о возросшей напряжённости функционирования иммунной системы и возможных дезадаптационных реакциях в условиях нарушенных циркадианных ритмов [1, 3]. Эти иммунобиологические эффекты нарушения светового режима могут быть опосредованы нейроэндокринными сдвигами, среди которых центральное место принадлежит функции ШЖ. Продуцируемый ШЖ гормон мелатонин является основным регулятором циркадианных ритмов в организме млекопитающих, обеспечивая синхронизацию метаболических процессов с 24-часовым ритмом чередования света и темноты. Содержание животных при КО в течение 14 сут вызывает у них состояние десинхроноза [5], проявляющееся снижением массы и весового индекса ШЖ, тенденцией к накоплению в ней липофусцина. Причиной этому может являться подавление синтеза мелатонина постоянным освещением [2], а также стрессовая реакция на нарушение светового режима [4]. Как в том, так и в другом случае происходит увеличение уровня свободных радикалов, что приводит к повышению количества липофусцина [13]. Обнаружено, что при естественном освещении масса ШЖ находится в прямой корреляционной связи с содержанием Т-клеток в селезенке. Поскольку масса ШЖ отражает количество в ней мелатонина [9], можно предположить, что данная связь свидетельствует о роли гормона в регуляции периферического Т-клеточного звена иммунитета в физиологических условиях. При этом небольшое число связей говорит о наличии достаточного количества степеней свободы в нейроэндокринно-иммунной системе и ее высоких адаптационных возможностях [3]. При КО увеличивается количество связей между показателями, характеризующими состояние ШЖ и иммунной системы, что свидетельствует о возросшей напряжённости межсистемных взаимоотношений [3]. Степень повреждения пинеалоцитов, маркером которого является накопление липофусцина, ассоциируется с уменьшением количества субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке, а снижение массы ШЖ - с увеличением доли незрелых тимоцитов. Эти изменения можно интерпретировать как результат снижения продукции мелатонина в ШЖ при КО [2]. Таким образом, у крыс КО вызывает изменение направленности клеточной миграции и дифференцировки в иммунной системе, рост напряжённости функционирования иммунной системы и нейроэндокринно-иммунных взаимодействий, опосредованное, по всей вероятности, блокадой синтеза мелатонина ШЖ. Результаты исследования свидетельствуют о важной роли ШЖ в регуляции функций иммунитета в физиологических условиях и при нарушении светового режима.

Об авторах

Галина Ивановна Литвиненко

Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН

лаборатория хронофизиологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 4

Анна Вениаминовна Шурлыгина

Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН

Email: anna_v_s@mail.ru
лаборатория хронофизиологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 4

Оксана Борисовна Грицык

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН

лаборатория иммуноморфологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 2

Евгения Владимировна Мельникова

Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН

лаборатория хронофизиологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 4

Павел Александрович Авроров

Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН

лаборатория хронофизиологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 4

Михаил Владимирович Тендитник

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН

лаборатория иммуноморфологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 2

Валерий Алексеевич Труфакин

Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины СО РАМН

лаборатория хронофизиологии 630117, Новосибирск-117, ул. акад. Тимакова, 4

Список литературы

Дополнительные файлы