INTERRELATIONS OF PINEAL GLAND MORPHO-FUNCTIONAL INDICES AND IMMUNE SYSTEM ORGANS IN RATS EXPOSED TO NATURAL ILLUMINATION REGIME AND CONTINUOUS ILLUMINATION

Full Text

Известно, что световой режим - один из самых сильных синхронизаторов суточных биологических ритмов у млекопитающих. Его нарушение вызывает состояние десинхроноза - рассогласования во времени физиологических процессов - и искажение периодической программы. Пусковым механизмом развития десинхроноза и дальнейшей органической патологии является нарушение ритма продукции мелатонина в шишковидной железе (ШЖ), которая обеспечивает сохранность биологических ритмов всего организма, в том числе и иммунной системы [2]. В современных условиях все большее число людей находятся в ситуациях, когда нарушается световой режим, что приводит к рассогласованию суточных биоритмов. Это перелеты через несколько часовых поясов, работа в условиях вахтовой организации труда в Сибири, Приполярных областях и на Крайнем Севере, работа в ночные смены или по «скользящему» графику. Показано, что у людей, подвергающихся действию аномального светового режима, увеличивается риск развития иммунодефицитных состояний, аллергических и онкологических заболеваний [7, 10]. Однако в настоящее время сведения о механизмах нарушений иммунитета при изменении ритма чередования светлого и темного времени суток немногочисленны и противоречивы. В связи с этим возникает необходимость исследования взаимоотношений морфофункциональных показателей ШЖ и иммунной системы в данных условиях. Цель настоящей работы - выявить комплексную реакцию ШЖ и органов иммунной системы в ответ на нарушение светового режима в эксперименте. Материал и методы. Работа проведена на самцах крыс линии Вистар в возрасте 4 мес. Одну группу (7 крыс) содержали при естественном световом режиме (ЕО), вторую (7 крыс) - при круглосуточном освещении (КО) в течение 14 сут, после чего крыс взвешивали и декапитировали под этаминаловым наркозом в утреннее время суток (с 10.00 до 12.00 ч). Для исследования брали кровь (из декапитационной раны), лимфоидные органы (тимус и селезенку), ШЖ. Органы взвешивали и вычисляли их весовые индексы по формуле: А/В, где А - масса органа, мг, В - масса тела, г. Из тимуса и селезёнки готовили клеточную суспензию, в камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток в крови и в суспензии из лимфоидных органов. Среди клеток тимуса и селезенки определяли долю и абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+8-, CD4-8+, CD4+25+, CD45RA+, CD11b/c с помощью соответствующих моноклональных антител, меченных флюоресцеин-изотиоцианатом и фикоэритрином (BD Pharmingen, США), на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Выделенные ШЖ помещали в среду для замораживания срезов NEG 50 (Thermo Microm Scientific, Германия), после чего замораживали при помощи жидкого азота. Срезы толщиной 10 мкм были приготовлены на микротоме-криостате HM 560 MV (Thermo Microm Scientific, Германия). Липофусцин в ШЖ исследовали, регистрируя и измеряя интенсивность аутофлюоресценции в криостатных срезах с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Для возбуждения аутофлюоресценции применяли аргоновый лазер (длина волны 488 нм), для измерений использовали объектив EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27. Измерение сигнала аутофлюоресценции осуществлялось в 2 канала: зеленый (длина волн от 505 до 545 нм) и красный (длина волн больше 560 нм) [11]. Конфокальная диафрагма для каждого канала была полностью открыта в связи с малой величиной интенсивности аутофлюоресценции. Для получения детальных снимков с большим увеличением использовали объектив Plan-Apochromat 100x/1,40 Oil DIC M27, конфокальная диафрагма для каждого канала была равна примерно 4,3 ед. Эйри. Все экспериментальные процедуры выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Эксперимент был проведен в зимнее время года (февраль 2013 г.). Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ для ПК «Statistica 7». Значимость различий между группами оценивали по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Проводили также корреляционный анализ с вычислением коэффициентов корреляции Спирмена. Результаты исследования. Выявлено, что при КО значимо снижаются масса ШЖ (2,2±0,4 мг при ЕО и 0,88±0,15 мг при КО, P<0,05), ее весовой индекс (0,010±0,002 при ЕО и 0,0030±0,0006 при КО, P<0,05). В ШЖ наблюдается тенденция к повышению содержания липофусцина (рис. 1) (39,2±1,2 усл. ед. в контроле и 46±4 усл. ед. при КО, P>0,05). Корреляционный анализ показал, что при ЕО между параметрами органов иммунной системы и ШЖ существует небольшое количество связей (рис. 2, а; таблица). Положительные корреляции определяются между массой ШЖ и ее весовым индексом, а также массой ШЖ и популяциями Т-лимфоцитов селезенки (CD3+, CD4+25+). Отрицательная связь была выявлена между весовым индексом ШЖ и массой тела. При КО количество корреляционных связей резко возрастает (см. рис. 2, б; таблицу). Положительные связи определяются между показателями ШЖ (количеством липофусцина, массой и весовым индексом ШЖ) и тимуса (масса, доли CD4+8+-и CD4+25+клеток). Отрицательные связи выявлены между количеством липофусцина в ШЖ и количеством популяций Т-лимфоцитов селезенки (CD4+8-, CD4+8+), а также между весовыми характеристиками ШЖ (массой и весовым индексом) и относительным содержанием субпопуляций тимоцитов (CD4-8+ и CD4-8+). Корреляционные связи между содержанием клеточных субпопуляций в лимфоидных органах и их весовыми характеристиками при ЕО представлены на рис. 3, а и в таблице. Положительные корреляционные связи обнаружены: между массой тимуса и относительным содержанием в нём CD4-8+-, CD4+8--субпопуляций, массой селезенки и относительным содержанием в органе В-лимфоцитов (CD45RA+). Отрицательная связь выявлена между массой тимуса и долей незрелых клеток в органе (CD4+8+). Корреляционные одного органа - тимуса или селезенки. Выявлена связи между численностью различных клеточных только одна межорганная положительная связь субпопуляций наблюдаются в основном внутри между абсолютным числом CD4-8+-тимоцитов и CD11b/c+-лимфоцитов селезенки. При КО количество, знак и направленность связей между показателями клеточного состава лимфоидных органов меняются, при этом увеличивается количество межорганных корреляционных связей между клеточным составом тимуса и селезенки (см. рис. 3, б; таблицу). Обсуждение полученных данных. Ранее было показано, что КО оказывает влияние на состояние иммунной системы - нарушает суточные ритмы клеточного состава лимфоидных органов, процессы пролиферации и центральной дифференцировки Т-лимфоцитов [5, 6]. Однако для характеристики состояния мультипараметричных систем, в том числе нейроиммуноэндокринной системы, имеют значение не только и не столько величины отдельных параметров, сколько их взаимоотношения между собой. Поэтому с целью получения более полной информации об иммунобиологических эффектах КО мы использовали основные положения концепции «мобилей», рассматривающей нейроэндокринно-иммунный гомеостаз как сложную систему компонентов, работающую во взаимосвязи всех ее составляющих, в которой напряженность функционирования определяется количеством и силой связей между отдельными параметрами [3]. Из результатов анализа корреляционных связей между массой лимфоидных органов и их клеточным составом можно сделать заключение, что при ЕО масса тимуса формируется за счет дифференцированных субпопуляций Т-лимфоцитов, а масса селезенки - за счет В-лимфоцитарной популяции. При КО масса селезенки связана только с численностью Т-лимфоцитов, что согласуется с полученными ранее данными о снижении содержания В-лимфоцитов в селезенке крыс под влиянием КО [6]. Вероятно, это связано с нарушением суточного ритма продукции кортикостерона [12] в условиях блокады синтеза мелатонина КО, что может вызвать изменения интенсивности и направленности миграции лимфоцитов из кровеносного русла в лимфоидные органы и ткани, в частности в селезенку [8]. Обнаружено, что изменение светового режима оказывает влияние на процессы центрального Т-лимфопоэза. При ЕО выявлена отрицательная связь между относительным содержанием в тимусе CD4+8+-незрелых тимоцитов и CD4-8+ лимфоцитов (зрелые эффекторы/киллеры), что позволяет предполагать направление дифференцировки тимоцитов в сторону данной субпопуляции. При КО отрицательная корреляционная связь наблюдается между относительным содержанием CD4+8+-и CD4+8--тимоцитов, т. е. в этих условиях меняется направление дифференцировки тимоцитов в строну субпопуляции хелперовиндукторов. Увеличение количества связей между субпопуляциями клеток тимуса и селезёнки при КО свидетельствует о возросшей напряжённости функционирования иммунной системы и возможных дезадаптационных реакциях в условиях нарушенных циркадианных ритмов [1, 3]. Эти иммунобиологические эффекты нарушения светового режима могут быть опосредованы нейроэндокринными сдвигами, среди которых центральное место принадлежит функции ШЖ. Продуцируемый ШЖ гормон мелатонин является основным регулятором циркадианных ритмов в организме млекопитающих, обеспечивая синхронизацию метаболических процессов с 24-часовым ритмом чередования света и темноты. Содержание животных при КО в течение 14 сут вызывает у них состояние десинхроноза [5], проявляющееся снижением массы и весового индекса ШЖ, тенденцией к накоплению в ней липофусцина. Причиной этому может являться подавление синтеза мелатонина постоянным освещением [2], а также стрессовая реакция на нарушение светового режима [4]. Как в том, так и в другом случае происходит увеличение уровня свободных радикалов, что приводит к повышению количества липофусцина [13]. Обнаружено, что при естественном освещении масса ШЖ находится в прямой корреляционной связи с содержанием Т-клеток в селезенке. Поскольку масса ШЖ отражает количество в ней мелатонина [9], можно предположить, что данная связь свидетельствует о роли гормона в регуляции периферического Т-клеточного звена иммунитета в физиологических условиях. При этом небольшое число связей говорит о наличии достаточного количества степеней свободы в нейроэндокринно-иммунной системе и ее высоких адаптационных возможностях [3]. При КО увеличивается количество связей между показателями, характеризующими состояние ШЖ и иммунной системы, что свидетельствует о возросшей напряжённости межсистемных взаимоотношений [3]. Степень повреждения пинеалоцитов, маркером которого является накопление липофусцина, ассоциируется с уменьшением количества субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке, а снижение массы ШЖ - с увеличением доли незрелых тимоцитов. Эти изменения можно интерпретировать как результат снижения продукции мелатонина в ШЖ при КО [2]. Таким образом, у крыс КО вызывает изменение направленности клеточной миграции и дифференцировки в иммунной системе, рост напряжённости функционирования иммунной системы и нейроэндокринно-иммунных взаимодействий, опосредованное, по всей вероятности, блокадой синтеза мелатонина ШЖ. Результаты исследования свидетельствуют о важной роли ШЖ в регуляции функций иммунитета в физиологических условиях и при нарушении светового режима.

About the authors

G. I. Litvinenko

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

A. V. Shurlygina

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: anna_v_s@mail.ru

O. B. Gritsyk

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

Ye. V. Mel’nikova

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

P. A Avrorov

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

M. V. Tenditnik

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology

V. A Trufakin

RAMS Siberian Branch Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

References

Supplementary files