РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГАМК-ЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В НЕОКОРТЕКСЕ У КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ

Полный текст

Острая гипоксия в неонатальный период является одной из основных причин возникновения патологии головного мозга у новорожденных, которая в настоящее время определяется как перинатальная энцефалопатия. Ее последствия могут проявляться в виде ряда нервно-психических расстройств и заболеваний. Известно, что воздействие гипоксии в перинатальный период вызывает изменение цитоархитектоники неокортекса, задержку нейроногенеза, пролонгированную гибель части нейронов, что в результате приводит к сокращению численности популяций разных типов нейронов в различных областях коры. Эти изменения сопровождаются нарушениями ряда физиологических поведенческих реакций [1-3]. Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), являясь мощным тормозным нейротрансмиттером, осуществляет контроль практически всех функций ЦНС; нейроны, синтезирующие ГАМК, присутствуют во всех формациях мозга. Однако особенности распределения ГАМК-ергических нейронов в неокортексе в ранний постнатальный период мало исследованы, а последствия воздействия перинатальной гипоксии на их распределение практически не изучены. ГАМК синтезируется из глутаминовой кислоты при участии фермента глутамат-декарбоксилазы (GAD). Одна из изоформ фермента - GAD-67, присутствующая в теле и отростках нейронов, широко используется как маркер ГАМК-ергических интернейронов [5]. Цель настоящей работы - изучить распределение GAD-67-иммунопозивных нейронов в разных областях неокортекса (фронтальной, сенсомоторной, зрительной) у крыс в разные сроки постнатального периода развития после воздействия перинатальной гипоксии. Материал и методы. Все процедуры были проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Воздействие гипоксии на головной мозг новорожденных крысят осуществляли в барокамере, оснащенной устройством для автоматически управляемого обогрева, смены газовой смеси и определения скорости потока газа. Азотно-кислородную газовую смесь готовили с помощью газосмесительной установки (Laorg, Франция). Подопытных животных помещали в барокамеру на 1 ч. Во время экспериментов содержание кислорода в барокамере составляло 7,6-7,8%; углекислого газа - 0,15-0,20%; азота - 91,8%; температура - 21,3-23 ºС; при нормальном общем давлении. В работе были использованы 2 группы животных: 1-я группа - крысята (n=18), подвергавшиеся в барокамере воздействию гипоксии (экспериментальная группа); 2-я группа (n=14) - интактные животные того же возраста (контрольная группа). Воздействие гипоксии осуществляли на 2-е постнатальные сутки. Изучение мозга как у контрольных, так и у экспериментальных животных проводили на 20-еи 40-е постнатальные сутки, т.е. в конце детского (ювенильного) периода и начале предпубертатного, когда начинается половое созревание и изменяется гормональный статус организма. В каждый срок исследования использовано по 5-6 животных. Для проведения гистологических исследований мозг крысят фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатносолевом буфере (рH 7,4) в течение 24 ч, обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике, готовили серийные фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм. Иммуноцитохимическую реакцию для выявления GAD-67 проводили с использованием кроличьих поликлональных антител (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов для GAD-67 использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP (DakoCytomation, США). Для визуализации продукта реакции пользовались хромогеном DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали гематоксилином Джилла и заключали в синтетическую заливочную среду Permaunt (Termo, США). При проведении иммуноцитохимической реакции все процедуры были стандартизированы и осуществлялись одновременно на гистологических срезах, полученных от контрольных и подопытных животных. На цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия), подсчитывали число GAD-67-иммунопозитивных нейронов на площади 0,1 мм² в разных слоях (II-VI) исследуемых областей неокортекса. Статистическую обработку полученных морфологических показателей осуществляли при помощи пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0, ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. В контроле на 20-еи 40-е сутки GAD-67-иммунопозивные нейроны присутствуют во всех слоях неокортекса, их довольно много, они диффузно равномерно рассеяны по всему неокортексу. Нейроны могут располагаться группами по 4-6 клеток, по 2 клетки или поодиночке. Иммуноцитохимическое исследование показало, что у контрольных животных (на 20-еи 40-е сутки) в исследуемых областях неокортекса (фронтальной, сенсомоторной, зрительной) в слоях II и III довольно большое количество GAD-67-иммунопозивных нейронов и в эти сроки значимо не различается (таблица). В слое IV на 20-е сутки численность иммунопозитивных нейронов высокая, однако, к 40-м суткам она в 2 раза снижается. В глубоких слоях V и VI количество меченых клеток также большое, однако их число в слое V с возрастом незначимо снижается, а в слое VI к 40-м суткам не изменяется (см. таблицу). У крыс, перенесших острую гипоксию в перинатальный период, как на 20-е, так и на 40-е сутки постнатального развития GAD-67иммунопозивные нейроны присутствуют во всех слоях неокортекса, распределены диффузно, однако их количество значимо меньше, чем в контроле (см. таблицу). У подопытных животных на 20-е сутки в верхних (II-III) слоях коры наблюдается значимое снижение численности иммунопозитивных нейронов по сравнению с таковой в контроле и к 40-м суткам она не изменяется. В слое IV на 20-е сутки количество иммунопозитивных нейронов снижается в 2 раза и остается таким же на 40-е сутки. В слое V также имеет место значимое уменьшение числа меченых нейронов по сравнению с таковым в контроле (рисунок, а, б), которое не увеличивается к 40-м суткам. В слое VI численность иммунопозитивных нейронов также значимо снижена по сравнению с контролем и с возрастом (к 40-м суткам) практически не меняется. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что на 20-е сутки после рождения у контрольных животных популяции нейронов, синтезирующих GAD-67, присутствуют в каждом слое неокортекса (II- VI), численность которых сохраняется к предпубертатному периоду развития (40-е сутки). Воздействие перинатальной гипоксии приводит к существенному снижению количества GAD67-экспрессирующих нейронов как в верхних, так и глубоких слоях коры в ювенильном возрасте, эта сокращенная численность меченых нейронов сохраняется к предпубертатному периоду (40-е сутки). У подопытных животных на 40-е сутки число GAD-67-синтезирующих нейронов в каждом из слоев неокортекса было в 2 раза ниже, чем в контроле. В настоящее время установлено, что в период развития в неокортексе происходит активная миграция клеток предшественников ГАМКергических нейронов. Существуют 2 популяции клеток-предшественников, появляющиеся в разные периоды развития и в различных областях развивающегося переднего мозга. Одна из них возникает в эмбриональный период в вентральной части переднего мозга (в субпаллиальной и преоптической областях), а другая - в пери-и постнатальный периоды развития в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков и зубчатой извилине гиппокампа [4]. Предполагают, что субвентрикулярная зона в неонатальный период включает 2 различные линии клетокпредшественников, дифференцировка которых идет по разным направлениям - нейрогенному и глиогенному. Нейрогенные предшественники локализуются предпочтительно в глубоких слоях коры и медленно функционально созревают [6, 7]. Наблюдающееся в данном исследовании резкое сокращение численности ГАМК-ергических нейронов в неокортексе у подопытных животных может быть результатом повреждающего воздействия острой перинатальной гипоксии на процессы миграции клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны либо на синтез факторов, контролирующих эти миграционные процессы, а также на созревание ГАМК-ергических нейронов и как результат - на более позднюю экспрессию GAD-67.

Об авторах

Людмила Ивановна Хожай

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: astarta0505@mail.ru
лаборатория онтогенеза нервной системы 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Владимир Александрович Отеллин

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: v.otellin@mail.ru
лаборатория онтогенеза нервной системы 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Список литературы

Дополнительные файлы