ЭКСПРЕССИЯ НЕЙРОТРОФИНА BDNF В ГИППОКАМПЕ И НЕОКОРТЕКСЕ У КРЫС ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ПОСТСТРЕССОВОГО ТРЕВОЖНОГО СОСТОЯНИЯ И ЕГО КОРРЕКЦИИ ГИПОКСИЧЕСКИМ ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЕМ

Полный текст

Нейротрофин BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) играет важную роль в росте, развитии и функционировании нейронов мозга, их выживаемости, нейрональной пластичности [8]. Кроме того, BDNF вовлекается в регуляцию таких важнейших процессов, как обучение, память, реакция на стресс [9, 11]. Имеются также сведения о возможной роли BDNF в развитии и лечении патологических состояний тревожнодепрессивного характера [3], однако этот вопрос исследован недостаточно. В связи с нарастающей распространенностью тревожно-депрессивных расстройств и достаточной эффективностью фармакотерапии имеющимися антидепрессантами очевидна необходимость уточнения патогенетических механизмов этих заболеваний и разработки новых, в том числе немедикаментозных способов, их коррекции. Одним из таких новых эффективных способов является гипоксическое посткондиционирование (ПостК) [1], обладающее мощным анксиолитическим свойством и корректирующее формирование тревожного состояния. Молекулярные механизмы гипоксического ПостК до настоящего времени практически не изучены, и их исследование также актуально. В связи с этим изучение возможного участия нейротрофина BDNF как в формировании тревожных патологических состояний, так и в их коррекции гипоксическим ПостК и являлось целью настоящей работы. Материал и методы. Методом количественной иммуногистохимии были исследованы изменения экспрессии BDNF в гиппокампе и неокортексе крыс при развитии тревожного состояния в модели посттравматического стрессового расстройства (ПТСР), а также после применения ПостК гипобарической (высотной) гипоксией, оказывающего анксиолитическое действие. Работа выполнена на 24 самцах крыс линии Вистар с массой тела 200-230 г. При проведении экспериментов были соблюдены требования, сформулированные в приказе Министерства высшего образования СССР № 724 (1984) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также директивах Совета Европейского Сообщества (86/609/ ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Для индукции тревожного состояния у крыс использовали экспериментальную модель ПТСР «стресс- рестресс» [6]. Животных подвергали иммобилизационному стрессу (120 мин), вынужденному плаванию (20 мин) и после 15 мин перерыва воздействию эфиром до обездвиженности. Через 7 сут животных подвергали рестрессу (30 мин иммобилизации), что приводило к формированию у них тревожного состояния. С целью коррекции последнего применяли гипоксическое ПостК по оригинальной схеме, ранее доказавшей свою эффективность [1]. ПостК осуществляли путем 3-кратной экспозиции умеренной гипобарической гипоксии (360 мм рт. ст., 2 ч) в барокамере проточного типа с 24-часовым интервалом, в первые 3 сут после рестресса. Крысы были разделены на следующие группы (в каждой группе по 6 животных): ПТСР - животные, подвергнутые «стрессу - рестрессу»; ПТСР-ПостК - животные, подвергнутые «стрессу - рестрессу» с последующей коррекцией патологии гипоксическим ПостК; контроль - интактные животные; контроль-Р - крысы, подвергнутые только рестрессу. Поскольку рестресс является слабым непатогенным стрессом у животных, не переживших травматический стресс, то группа контроль-Р включена в исследование в качестве образца адаптивного (а не патологического, как у группы ПТСР) ответа на рестресс. Животных декапитировали через 4 сут после рестресса. Мозг быстро извлекали, выделяли сегмент, включающий области гиппокампа с прилежащим париетальным неокортексом. Образцы фиксировали молекулярным фиксатором FineFIX (Milestone, Италия). Далее препараты подвергали стандартным процедурам промывки, обезвоживания, проведения через порции ксилола и заливали в парафин. Затем при помощи микротома изготавливали серии срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм. В полученных срезах методом количественной иммуногистохимии были исследованы изменения экспрессии BDNF в неокортексе, дорсальном (СА1) и вентральном (зубчатая извилина) гиппокампе. Для этого после процедур депарафинирования, регидратации и температурной демаскировки антигена срезы в течение ночи при 4 ºC инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами к BDNF (Santa Cruz, США, разведение - 1:100), после чего использовали авидин-биотиновую систему детекции (Vector Laboratories, Inc, Великобритания) и визуализацию диаминобензидином. Количественный анализ иммунореактивности нейронов проводили с использованием системы анализа микроизображений, состоящей из светового микроскопа Olympus CX31RBSF (Optical systems, Германия), цифровой камеры ProgResCT1 (Jenoptik, Германия) и компьютера с программным обеспечением ВидеоТест Морфология 5.2 (ВидеоТест, Россия). Подсчитывали число иммунореактивных клеток в поле СА1 гиппокампа и зубчатой извилине (на участке длиной 400 мкм) и в неокортексе (на участке размером 350×400 мкм) на уровне -2,80 мм от брегмы. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по U-критерию Манна-Уитни (Statistica7.0, Stat-Soft Inc.). Различия между выборками считали значимыми при Р≤0,05. Все результаты по экспериментальным группам представлены в виде среднего арифметического±SEM (standard error of the mean). Результаты исследования. Воздействие патогенным стрессом (группа ПТСР) приводило к значительному снижению иммунореактивности, что проявлялось отчетливым уменьшением интенсивности иммуногистохимической реакции в гиппокампе и неокортексе (рис. 1, в, ж) по сравнению с аналогичными областями у контрольных крыс (см. рис. 1, a, д). Количественный анализ показал, что как в вентральном (зубчатая извилина - рис. 2, а), так и в дорсальном (СА1 - см. рис. 2, б) гиппокампе, а также неокортексе (см. рис. 2, в) число BDNFиммунопозитивных клеток в группе ПТСР значимо снизилось на 60-70%. В группе слабострессированных животных (контроль-Р) значимых отличий от контроля не выявлено ни при качественной оценке (см. рис. 1, б, е), ни при количественном анализе (см. рис. 2). В группе ПТСР-ПостК (ПостК после «стресса-рестресса») отмечено увеличение количества BDNF-иммунопозитивных клеток (см. рис. 1, г, з), значимо отличающееся от показателей в группе ПТСР в зубчатой извилине и неокортексе, причем в неокортексе количество этих клеток достигает контрольных показателей (см. рис. 2). Обсуждение полученных данных. ПТСР - это одно из наиболее распространенных тревожно-депрессивных заболеваний. Оно характеризуется резким повышением тревожности и полным расстройством адаптации. Насколько известно в настоящее время, важную роль в патогенезе данного заболевания играют нарушения экспрессии различных генов и их продуктов в нейронах мозга, одним из которых и является нейротрофин BDNF. У пациентов с ПТСР было описано снижение экспрессии мРНК BDNF в гиппокампе [5, 11]. С этим согласуются полученные в нашей работе данные о снижении содержания белка BDNF в гиппокампе и неокортексе при формировании модельного аналога ПТСР у крыс. В отличие от остальных нейротрофинов, для BDNF показано значительное влияние на синаптическую передачу, участие в формировании долговременной потенциации, а также установлена зависимость его экспрессии и секреции от нейрональной активности [7]. Связывание BDNF с рецептором (TrB FL) приводит к активации сигнального пути фосфолипазы Сγ, PI-3-киназного и Akt-киназного путей, МЕК-МАРК (митоген-активирующаяся протеинкиназа) сигнального пути [12]. МАРКопосредованное фосфорилирование везикулярного белка синапсина регулирует пресинаптический выброс глутамата и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) [2]. Таким образом, уменьшение содержания BDNF, наблюдаемое при ПТСР, может приводить к снижению выброса этих двух медиаторов. В случае с тормозным медиатором, ГАМК, это может приводить к снижению активности рецепторов ГАМК-Аи, следовательно, повышению тревожности, характерной для ПТСР и других расстройств этой группы [10]. Кроме того, известно, что у пациентов с ПТСР развивается атрофия гиппокампа, предположительно, вследствие токсического действия глюкокортикоидов, высокое содержание которых достигается в условиях патогенного стресса [13]. Это может быть обусловлено и пониженным содержанием BDNF, следствием чего является снижение резистентности нейронов гиппокампа к повреждающим факторам и их потенциала нейропластичности [4]. Результаты настоящей работы позволяют предполагать, что снижение экспрессии BDNF в гиппокампе и неокортексе является важным патогенетическим механизмом ПТСР, о чем свидетельствуют данные, полученные нами на ПостК-животных. Установлено, что протективный эффект ПостК в модели ПТСР сопровождается стимуляцией экспрессии BDNF, приводящей либо к частичному (гиппокамп), либо к полному (неокортекс) восстановлению содержания данного нейротрофина, значительно редуцированного при ПТСР. Вероятно, это способствует стимуляции процессов нейропластичности в данных уязвимых образованиях мозга, а также нормализует нарушенный выброс медиаторов, что компенсирует негативные последствия патогенного стресса. Таким образом, в настоящей работе в экспериментальных моделях на крысах установлено, что редукция содержания BDNF в гиппокампе и некортексе сопровождает формирование постстрессорной тревожной патологии, а терапевтический и анксиолитический эффект гипоксического ПостК связан со стимуляцией экспрессии данного нейротрофического фактора в уязвимых структурах мозга.

Об авторах

Михаил Юрьевич Зенько

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: zenkomichail@mail.ru
лаборатория регуляции функций нейронов мозга 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Елена Александровна Рыбникова

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: rybnikova1@rambler.ru
лаборатория нейроэндокринологии 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Татьяна Сергеевна Глущенко

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: anoxia@pavlov.infran.ru
лаборатория регуляции функций нейронов мозга 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Список литературы

Дополнительные файлы