ВЛИЯНИЕ ИМПЛАНТАЦИИ МИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА НА РЕГЕНЕРАЦИЮ СУСТАВНОГО ХРЯЩА

Полный текст

Хирургические методы лечения при повреждении или утрате суставного хряща вследствие врожденных аномалий, дегенеративных заболеваний или травм часто оказываются недостаточными и во многих случаях не приводят к ожидаемому полноценному его возмещению [9, 10]. В связи с этим разработка, научное обоснование и экспериментально-морфологическая апробация биоматериалов, обладающих хондрогенной активностью, являются одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Наиболее широко используемые биоматериалы: деминерализованный костный матрикс, матрицы из полимолочных и полигликолевых кислот, коллагеновые криогели, аналоги костного минерала, полисахариды природного происхождения характеризуются низкой пластической эффективностью, отсутствием хондрогенной активности, ограниченной биосовместимостью [1, 5, 7, 12]. Ранее проведенные нами исследования показали, что минерализованный костный матрикс (МКМ), полученный по оригинальной технологии без применения термической и деминерализующей обработки [6], обладает остеоиндуктивным свойством и является эффективным стимулятором остеогенеза [4]. Цель настоящей работы - морфологический анализ репаративного хондрогенеза при имплантации в зону повреждения хряща коленного сустава данного биоматериала - МКМ. Материал и методы. В работе использованы 25 половозрелых крыс линии Вистар массой 340-390 г (20 подопытных и 5 интактных). Содержание, эксперименты и эвтаназия животных соответствовали требованиям, указанным в нормативных документах [2]. У подопытных крыс в условиях операционной с использованием общей анестезии (рометар 8 мг и золетил 4 мг на 1000 г массы тела внутримышечно) на пателлярной поверхности дистального конца левой и правой бедренной кости зубным бором моделировали несквозные окончатые дефекты диаметром 2,5-3 мм до проникновения в субхондральную кость. В область дефекта правой кости вводили стерильный гранулированный аллогенный МКМ массой 2-3 мг, полученный из трубчатых костей беспородных крыс по оригинальной технологии [6]. Зону дефекта левой кости оставляли заживать под кровяным сгустком и использовали в качестве контроля. У 5 интактных здоровых крыс для сравнения исследовали хрящ коленного сустава. Через 7, 15, 30 и 60 сут после операции подопытных животных выводили из эксперимента (использовали по 5 животных на каждую временнýю точку). Бедренные кости оперированных подопытных и интактных животных фиксировали в 2% растворе параформальдегида и 2% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) и заливали в парафин (после декальцинации) и аралдит (без декальцинации). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином - эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону и альциановым синим (Alcian blue 8GS) при рН 2,5 и 1,0 для выявления несульфатированных (НСГАГ) и сульфатированных гликозаминогликанов (СГАГ) соответственно. Содержание ГАГ (в усл. уд.) оценивали, определяя концентрацию альцианового синего в срезах, которую измеряли при помощи энергодисперсионного рентгеновского спектрометра (рентгеновского электронно-зондового микроанализатора) INCA-200 Energy (Oxford Instruments, Англия) [3]. Структуру гранул МКМ и регенератов в зоне повреждения исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония) и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-2010 (Jeol, Япония). Результаты количественных исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Значимость различий сравниваемых параметров рассчитывали с использованием критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при уровне Р<0,05. Результаты исследования. Имплантированные гранулы МКМ имеют размер 50-200 мкм в поперечнике и упорядоченную высокопористую структуру. Поры соответствуют местам локализации лакун остеоцитов и костных канальцев, из которых клетки и другие органические компоненты были удалены при получении биоматериала. Установлено, что через 7 сут после операции в левой и правой конечности суставная капсула гиперемирована и отечна. Хрящевое покрытие имеет матовый оттенок. В зоне повреждения выявляются признаки воспалительной реакции и альтеративно-деструктивные преобразования, затрагивающие все компоненты метаэпифиза. Обнаруживаются очаги организованной гематомы, сгустки фибрина, инфильтрированные малодифференцированными клеточными элементами, нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками и экстравазальными эритроцитами. Выявляются лейкоцитарнонекротические массы, содержащие лизированные клетки и пласты фибрина. Суставной хрящ скарифицирован. Зона дефекта частично восполняется грануляционной и малодифференцированной рыхлой соединительной тканью с признаками отека и немногочисленными сосудами. В правой кости (опыт) в зоне повреждения наблюдаются единичные костно-остеоидные очаги и тонкие костные трабекулы. Репаративное костеобразование осуществляется по типу интрамембранного остеогенеза. Содержание НСГАГ и СГАГ в зоне повреждения суставного хряща значительно снижено по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных (0,59±0,03 и 0,68±0,03 усл. ед. соответственно), однако значимых изменений в их содержании в контроле и опыте на этом этапе эксперимента не выявлено (таблица). Через 15 сут после операции в контрольной кости в центральной зоне дефекта выявляется грануляционная ткань, содержащая многочисленные лейкоциты, фибробластические элементы, пучки коллагеновых волокон и значительное количество расширенных и заполненных кровью сосудов. В правой кости (опыт) клеточные элементы, характерные для воспаления, не выявляются, репаративное костеобразование осуществляется не только по типу интрамембранного, но и энхондрального остеогенеза. В зоне повреждения субхондральной кости формируется обширная мелкопетлистая сеть утолщенных трабекул, покрытых рядами многочисленных крупных остеобластов, образующих губчатую кость, тесно спаянную с поверхностью подлежащей кости. Имплантируемые гранулы МКМ имеют вид кистозных полостей, образовавшихся при декальцинации образца и вследствие биодеструкции, внутри них располагаются фукционально активные остеокласты с многочисленными ядрами и гофрированным краем (рис. 1). Многочисленные синусоидные капилляры окружены пролиферирующими периваскулярными клетками. В этих участках отсутствуют геморрагии и очаги деструкции, отмечается активная пролиферация фибробластов, интенсивный неоангиогенез, на поверхности гранул МКМ располагаются слои остео-и хондрогенных клеток на различных этапах дифференцировки. Зона дефекта суставного хряща частично заполняется новообразованным гиалиновым хрящом, межклеточное вещество которого содержит, преимущественно, НСГАГ (см. таблицу). Края дефекта сливаются с краями не поврежденного в процессе операции суставного хряща, где выявляются изогенные группы хондроцитов. Наличие последних свидетельствует о пролиферативной активности части хондроцитов, являющихся одним из источников хрящевой ткани, заполняющей дефект. Вторым источником хондроцитов являются клетки, располагающиеся вокруг гранул МКМ, и третьим - хондроциты в зоне энхондрального остеогенеза в участках заживления субхондральной кости. Концентрация ГАГ в зоне дефекта в опыте более чем в 2 раза превосходит контрольные значения (см. таблицу). Через 30 и 60 сут после операции в контроле значительный объем зоны дефекта заполнен рыхлой или плотной соединительной тканью (рис. 2, а, в). Новообразованная хрящевая ткань формируется лишь в области субхондральной кости в результате ее повреждения и лентовидными сруктурами отрастает от краев дефекта. В опыте дефект суставного хряща почти полностью заполнен новообразованным гиалиновым хрящом с гладкой поверхностью (см. рис. 2, б, г), который растет не только от субхондральной кости, но и, главным образом, от краев дефекта, где располагаются изогенные группы клеток, что свидетельствует о пролиферативной активности хондроцитов. Поверхность новообразованного гиалинового хряща приобретает свойственный суставному хрящу интактных животных блеск. Клеточная популяции хрящевого регенерата представлена в основном пролиферирующими хондроцитами, его строение еще не имеет характерной для суставного хряща специфичности. Содержание НСГАГ и СГАГ через 30 сут после операции в дефекте и опыте более чем в 2 раза превосходит контрольные показатели, но между собой значимо не различается, тогда как через 60 сут СГАГ преобладают, что свидетельствует о более высокой степени зрелости новообразованной хрящевой ткани (см. таблицу), достигающей степени зрелости, свойственной суставному хрящу у интактных животных. Обсуждение полученных данных. Известно, что зрелый гиалиновый хрящ обладает незначительным потенциалом восстановления вследствие низкой плотности расположения клеток и малой митотической активности хондроцитов [9, 14]. Крупные дефекты суставного хряща замещаются биомеханически неполноценным волокнистым хрящом с последующим развитием остеоартрита [10]. Появление методов тканевой инженерии предоставило альтернативные возможности для лечения таких пациентов путем применения клеточной терапии в сочетании с синтетическими заменителями внеклеточного матрикса и биологически активными факторами для функциональной замены суставного гиалинового хряща [11-13]. Проведенные исследования показали, что гранулы МКМ при имплантации в зону дефекта суставного хряща, выявляющиеся во все сроки последующего наблюдения, оказывают хондромодулирующее действие, пролонгированно активизируют репаративный хондро-и остеогенез. В зоне повреждения суставного хряща в ранние сроки формируется регенерат, приобретающий клеточную специфику гиалинового хряща, образуется целостное хрящевое покрытие, постепенно выравниваются нарушенные контуры суставной поверхности, что приводит к полному или частичному восстановлению функциональной активности сустава. Свойства хондро-и остеоиндуктора имплантационным гранулам МКМ обеспечивают содержащиеся в них факторы роста и костные морфогенетические белки, которые выделяются при остеокластической резорбции [1, 8]. Таким образом, проведенные исследования показали, что применение имплантата из гранулированного МКМ в качестве стимулятора хондро-и остеогенеза и корректора деструктивных нарушений в костной и хрящевой ткани при повреждениях суставного хряща представляется теоретически обоснованным и перспективным и указывают на возможность использования МКМ в клинической практике при лечении повреждений и заболеваний суставного хряща.

Об авторах

Юрий Михайлович Ирьянов

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: irianov@mail.ru
лаборатория морфологии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Николай Александрович Кирьянов

Ижевская государственная медицинская академия

Email: kirnik@igma.udm.ru
кафедра патологической анатомии 426034, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281

Ольга Владимировна Дюрягина

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

лаборатория морфологии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы