THE EFFECT OF IMPLANTATION OF MINERALIZED BONE MATRIX ON THE REGENERATION OF ARTICULAR CARTILAGE

Full Text

Хирургические методы лечения при повреждении или утрате суставного хряща вследствие врожденных аномалий, дегенеративных заболеваний или травм часто оказываются недостаточными и во многих случаях не приводят к ожидаемому полноценному его возмещению [9, 10]. В связи с этим разработка, научное обоснование и экспериментально-морфологическая апробация биоматериалов, обладающих хондрогенной активностью, являются одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Наиболее широко используемые биоматериалы: деминерализованный костный матрикс, матрицы из полимолочных и полигликолевых кислот, коллагеновые криогели, аналоги костного минерала, полисахариды природного происхождения характеризуются низкой пластической эффективностью, отсутствием хондрогенной активности, ограниченной биосовместимостью [1, 5, 7, 12]. Ранее проведенные нами исследования показали, что минерализованный костный матрикс (МКМ), полученный по оригинальной технологии без применения термической и деминерализующей обработки [6], обладает остеоиндуктивным свойством и является эффективным стимулятором остеогенеза [4]. Цель настоящей работы - морфологический анализ репаративного хондрогенеза при имплантации в зону повреждения хряща коленного сустава данного биоматериала - МКМ. Материал и методы. В работе использованы 25 половозрелых крыс линии Вистар массой 340-390 г (20 подопытных и 5 интактных). Содержание, эксперименты и эвтаназия животных соответствовали требованиям, указанным в нормативных документах [2]. У подопытных крыс в условиях операционной с использованием общей анестезии (рометар 8 мг и золетил 4 мг на 1000 г массы тела внутримышечно) на пателлярной поверхности дистального конца левой и правой бедренной кости зубным бором моделировали несквозные окончатые дефекты диаметром 2,5-3 мм до проникновения в субхондральную кость. В область дефекта правой кости вводили стерильный гранулированный аллогенный МКМ массой 2-3 мг, полученный из трубчатых костей беспородных крыс по оригинальной технологии [6]. Зону дефекта левой кости оставляли заживать под кровяным сгустком и использовали в качестве контроля. У 5 интактных здоровых крыс для сравнения исследовали хрящ коленного сустава. Через 7, 15, 30 и 60 сут после операции подопытных животных выводили из эксперимента (использовали по 5 животных на каждую временнýю точку). Бедренные кости оперированных подопытных и интактных животных фиксировали в 2% растворе параформальдегида и 2% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) и заливали в парафин (после декальцинации) и аралдит (без декальцинации). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином - эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону и альциановым синим (Alcian blue 8GS) при рН 2,5 и 1,0 для выявления несульфатированных (НСГАГ) и сульфатированных гликозаминогликанов (СГАГ) соответственно. Содержание ГАГ (в усл. уд.) оценивали, определяя концентрацию альцианового синего в срезах, которую измеряли при помощи энергодисперсионного рентгеновского спектрометра (рентгеновского электронно-зондового микроанализатора) INCA-200 Energy (Oxford Instruments, Англия) [3]. Структуру гранул МКМ и регенератов в зоне повреждения исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония) и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-2010 (Jeol, Япония). Результаты количественных исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Значимость различий сравниваемых параметров рассчитывали с использованием критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при уровне Р<0,05. Результаты исследования. Имплантированные гранулы МКМ имеют размер 50-200 мкм в поперечнике и упорядоченную высокопористую структуру. Поры соответствуют местам локализации лакун остеоцитов и костных канальцев, из которых клетки и другие органические компоненты были удалены при получении биоматериала. Установлено, что через 7 сут после операции в левой и правой конечности суставная капсула гиперемирована и отечна. Хрящевое покрытие имеет матовый оттенок. В зоне повреждения выявляются признаки воспалительной реакции и альтеративно-деструктивные преобразования, затрагивающие все компоненты метаэпифиза. Обнаруживаются очаги организованной гематомы, сгустки фибрина, инфильтрированные малодифференцированными клеточными элементами, нейтрофильными гранулоцитами, лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками и экстравазальными эритроцитами. Выявляются лейкоцитарнонекротические массы, содержащие лизированные клетки и пласты фибрина. Суставной хрящ скарифицирован. Зона дефекта частично восполняется грануляционной и малодифференцированной рыхлой соединительной тканью с признаками отека и немногочисленными сосудами. В правой кости (опыт) в зоне повреждения наблюдаются единичные костно-остеоидные очаги и тонкие костные трабекулы. Репаративное костеобразование осуществляется по типу интрамембранного остеогенеза. Содержание НСГАГ и СГАГ в зоне повреждения суставного хряща значительно снижено по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных (0,59±0,03 и 0,68±0,03 усл. ед. соответственно), однако значимых изменений в их содержании в контроле и опыте на этом этапе эксперимента не выявлено (таблица). Через 15 сут после операции в контрольной кости в центральной зоне дефекта выявляется грануляционная ткань, содержащая многочисленные лейкоциты, фибробластические элементы, пучки коллагеновых волокон и значительное количество расширенных и заполненных кровью сосудов. В правой кости (опыт) клеточные элементы, характерные для воспаления, не выявляются, репаративное костеобразование осуществляется не только по типу интрамембранного, но и энхондрального остеогенеза. В зоне повреждения субхондральной кости формируется обширная мелкопетлистая сеть утолщенных трабекул, покрытых рядами многочисленных крупных остеобластов, образующих губчатую кость, тесно спаянную с поверхностью подлежащей кости. Имплантируемые гранулы МКМ имеют вид кистозных полостей, образовавшихся при декальцинации образца и вследствие биодеструкции, внутри них располагаются фукционально активные остеокласты с многочисленными ядрами и гофрированным краем (рис. 1). Многочисленные синусоидные капилляры окружены пролиферирующими периваскулярными клетками. В этих участках отсутствуют геморрагии и очаги деструкции, отмечается активная пролиферация фибробластов, интенсивный неоангиогенез, на поверхности гранул МКМ располагаются слои остео-и хондрогенных клеток на различных этапах дифференцировки. Зона дефекта суставного хряща частично заполняется новообразованным гиалиновым хрящом, межклеточное вещество которого содержит, преимущественно, НСГАГ (см. таблицу). Края дефекта сливаются с краями не поврежденного в процессе операции суставного хряща, где выявляются изогенные группы хондроцитов. Наличие последних свидетельствует о пролиферативной активности части хондроцитов, являющихся одним из источников хрящевой ткани, заполняющей дефект. Вторым источником хондроцитов являются клетки, располагающиеся вокруг гранул МКМ, и третьим - хондроциты в зоне энхондрального остеогенеза в участках заживления субхондральной кости. Концентрация ГАГ в зоне дефекта в опыте более чем в 2 раза превосходит контрольные значения (см. таблицу). Через 30 и 60 сут после операции в контроле значительный объем зоны дефекта заполнен рыхлой или плотной соединительной тканью (рис. 2, а, в). Новообразованная хрящевая ткань формируется лишь в области субхондральной кости в результате ее повреждения и лентовидными сруктурами отрастает от краев дефекта. В опыте дефект суставного хряща почти полностью заполнен новообразованным гиалиновым хрящом с гладкой поверхностью (см. рис. 2, б, г), который растет не только от субхондральной кости, но и, главным образом, от краев дефекта, где располагаются изогенные группы клеток, что свидетельствует о пролиферативной активности хондроцитов. Поверхность новообразованного гиалинового хряща приобретает свойственный суставному хрящу интактных животных блеск. Клеточная популяции хрящевого регенерата представлена в основном пролиферирующими хондроцитами, его строение еще не имеет характерной для суставного хряща специфичности. Содержание НСГАГ и СГАГ через 30 сут после операции в дефекте и опыте более чем в 2 раза превосходит контрольные показатели, но между собой значимо не различается, тогда как через 60 сут СГАГ преобладают, что свидетельствует о более высокой степени зрелости новообразованной хрящевой ткани (см. таблицу), достигающей степени зрелости, свойственной суставному хрящу у интактных животных. Обсуждение полученных данных. Известно, что зрелый гиалиновый хрящ обладает незначительным потенциалом восстановления вследствие низкой плотности расположения клеток и малой митотической активности хондроцитов [9, 14]. Крупные дефекты суставного хряща замещаются биомеханически неполноценным волокнистым хрящом с последующим развитием остеоартрита [10]. Появление методов тканевой инженерии предоставило альтернативные возможности для лечения таких пациентов путем применения клеточной терапии в сочетании с синтетическими заменителями внеклеточного матрикса и биологически активными факторами для функциональной замены суставного гиалинового хряща [11-13]. Проведенные исследования показали, что гранулы МКМ при имплантации в зону дефекта суставного хряща, выявляющиеся во все сроки последующего наблюдения, оказывают хондромодулирующее действие, пролонгированно активизируют репаративный хондро-и остеогенез. В зоне повреждения суставного хряща в ранние сроки формируется регенерат, приобретающий клеточную специфику гиалинового хряща, образуется целостное хрящевое покрытие, постепенно выравниваются нарушенные контуры суставной поверхности, что приводит к полному или частичному восстановлению функциональной активности сустава. Свойства хондро-и остеоиндуктора имплантационным гранулам МКМ обеспечивают содержащиеся в них факторы роста и костные морфогенетические белки, которые выделяются при остеокластической резорбции [1, 8]. Таким образом, проведенные исследования показали, что применение имплантата из гранулированного МКМ в качестве стимулятора хондро-и остеогенеза и корректора деструктивных нарушений в костной и хрящевой ткани при повреждениях суставного хряща представляется теоретически обоснованным и перспективным и указывают на возможность использования МКМ в клинической практике при лечении повреждений и заболеваний суставного хряща.

About the authors

Yu. I. Iryanov

Russian G. A. Ilizarov Scientific Center of Restorative Traumatology and Orthopaedics

Email: irianov@mail.ru

N. A. Kiryanov

Izhevsk State Medical Academy

Email: kirnik@igma.udm.ru

O. V. Diuriagina

Russian G. A. Ilizarov Scientific Center of Restorative Traumatology and Orthopaedics

References

Supplementary files