РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ И НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В СПИННОМ МОЗГУ У НОВОРОЖДЕННЫХ И ВЗРОСЛЫХ КРЫС

Полный текст

Первые исследования холинергической медиаторной системы спинного мозга (СМ), выполненные еще в 30-х годах XX в. H. Dale и соавт. [10], показали наличие ацетилхолина (АЦХ) в нервномышечных синапсах, образуемых двигательным нейроном СМ. В 40-х годах XX в. с применением нейрофармакологических и электрофизиологических методов было убедительно доказано участие АЦХ в передаче нервных импульсов в СМ. В настоящее время морфологические исследования холинергических нейронов ведутся с помощью иммуноцитохимического выявления ключевого фермента синтеза АЦХ - холинацетилтрансферазы (ХАТ) [3, 6, 15]. Присутствие оксида азота (NO), как нейромедиатора, в СМ было установлено в 90-х годах XX в. Для выявления NO-ергических структур наиболее часто применяют иммуногистохимическую реакцию на нитрокидсинтазу (NOS) - фермент, участвующий в синтезе NO в клетках из L-аргинина [5, 21]. До настоящего времени предметом дискуссий являются функции NO в нервной системе и взаимосвязь NO-ергической и холинергической медиаторных систем. Цель настоящего исследования состояла в изучении и сопоставлении пространственного распределения холин-и NO-ергических структур СМ у новорожденных и взрослых крыс. Материал и методы. При выполнении работы использовали СМ взрослых крыс (n=5) и новорожденных крысят (n=5) линии Вистар. Содержание, умерщвление животных, эксперименты осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Исследовали шейный отдел СМ на уровне III-V сегментов, который фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде в течение 1 сут. СМ взрослых крыс фиксировали с окружающими тканями (включая костную) и, в связи с этим, подвергали декальцинации в растворе муравьиной кислоты [2]. СМ новорожденных крысят не декальцинировали. Далее материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм подготавливали к иммуногистохимическим исследованиям по общепринятой методике. Перед проведением иммуногистохимической реакции на ХАТ и NOS производили тепловое демаскирование антигенов. Для выявления ХАТ использовали первичные козьи поликлональные антитела (Chemicon, США) в разведении 1:250 [3]. В качестве вторичных антител использовали кроличьи антикозьи биотинилированные антитела (Dako, Дания) в разведении 1:200 и конъюгат стрептавидин-пероксидазу (Spring Bioscience, США). NO-синтазу в клетках СМ выявляли, используя кроличьи поликлональные антитела (Spring Bioscience - кат. номер Е3934, США) в разведении 1:500, а также вторичные антитела «HRP conjugate» из набора Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System (Spring Bioscience, США). Визуализацию прореагировавших антител проводили с применением диаминобензидина (DAB+Dako, Дания). Часть препаратов докрашивали астровым синим. Исследование и фотографирование препаратов, заключенных в среду Cytoseal 60 (Thermo-Scientific, США), проводили при помощи микроскопа Leica DM 750 и фотокамеры ICC 50 (Leica, Германия). Для анализа полученных изображений использовали компьютерную программу LAS EZ (Leica, Германия), позволяющую оценить размер клеток. Локализацию иммунопозитивных структур определяли с помощью атласа СМ крыс [23]. Совместную колокализацию исследуемых ферментов в нейронах определяли на последовательных срезах, позволяющих проследить топографию клеток в СМ. Результаты исследования. ХАТиммунопозитивные структуры в сером веществе шейного отдела СМ у новорожденных крысят располагаются в следующих областях: глубокие слои задних рогов, VI, IX и Х пластинки Рекседа. В задних рогах серого вещества (III-V пластинки) обнаружены немногочисленные мелкие (до 16×7 мкм) нейроны с интенсивной окраской цитоплазмы. В области I-V пластинок выявляются ХАТ-содержащие волокна. Более крупные иммунопозитивные клетки локализуются в центральном сером веществе (X пластинка Рекседа). Тела клеток имеют веретеновидную или округлую форму и достигают размеров 18×14 мкм. Отростки этих клеток также содержат ХАТ и образуют сеть. В промежуточной зоне серого вещества СМ ХАТэкспрессирующие клетки идентифицированы на границе между VI и VII пластинками Рекседа. Здесь определяются крупные (до 30×16 мкм) иммунопозитивные клетки звездчатой формы с интенсивно окрашенными толстыми отростками. ХАТ-экспрессирующие клетки передних рогов сгруппированы в области IX пластинки Рекседа (рис. 1, а). Они представляют собой клетки с крупными телами (от 17×12 до 31×27 мкм) и большим количеством иммунопозитивных отростков, образующих густую сеть. Интенсивность реакции цитоплазмы клеток данной области ниже, чем клеток центрального серого вещества и VI пластинки Рекседа. На телах отдельных клеток IX пластинки определяются ХАТ-иммунопозитивные структуры, напоминающие аксосоматические синапсы. Такие же структуры присутствуют и на дендритах нейронов, являясь, по-видимому, аксодендритными синапсами. При изучении экспрессии ХАТ в шейном отделе СМ у взрослой крысы выявлены несколько областей с интенсивной иммуногистохимической реакцией. В области задних рогов СМ ХАТ-иммунопозитивность проявляют в основном отростки нейронов, образуя сеть в I-IV пластинках Рекседа. Однако в ходе исследования выявлено несколько мелких клеток, экспрессирующих ХАТ, расположенных во II-V пластинках. Отмечено, что ХАТ-содержащие нейроны II-III пластинок имеют веретеновидную форму (размеры от 17×6 до 20×8 мкм), а клетки IV пластинки Рекседа, преимущественно, округлые диаметром 15-16 мкм. В центральном сером веществе (Х пластинка Рекседа) экспрессия ХАТ наблюдается в цитоплазме мелких (около 25×15 мкм) интернейронов. Клетки имеют веретеновидную или овальную форму, вытянуты в медиолатеральном направлении. Отростки этих клеток также содержат ХАТ и образуют сеть. Некоторые иммунопозитивные волокна достигают области IX пластинки Рекседа. На границе между VI и VII пластинками выявлены ХАТ-иммунопозитивные веретеновидные нейроны (размер до 30×24 мкм) с интенсивной окраской цитоплазмы. Клетки ориентированы медиолатерально, отростки некоторых клеток достигают Х пластинки Рекседа и области боковых рогов СМ. В передних рогах серого вещества СМ в области IX пластинки Рекседа идентифицированы ХАТсодержащие крупные (до 44×34 мкм) и средние (до 35×27 мкм) клетки с яркоокрашенной цитоплазмой (см. рис. 1, б). Среди иммунопозитивных нейронов присутствуют клетки с менее интенсивной окраской. Кроме того, в передних рогах серого вещества выявлена густая сеть волокон, содержащих ХАТ. Также экспрессия ХАТ отмечена в отростках нейронов, проходящих через белое вещество и образующих вентральные корешки спинномозговых нервов. На плазмолемме крупных и средних ХАТ-содержащих нейронов, а также на крупных дендритах расположены иммунопозитивные структуры, похожие на синаптические бутоны (см. рис. 1, б). Подобные структуры обнаружены и на ХАТ-иммунонегативных клетках в области VIII-IX пластинок Рекседа. При проведении иммуногистохимического исследования шейного отдела СМ у новорожденных крысят в сером веществе выявлено несколько областей NOS-иммунореактивности. В задних рогах СМ NOS-содержащие нейроны располагаются преимущественно в III-IV пластинках Рекседа (рис. 2). Также несколько мелких иммунопозитивных клеток обнаружено во II пластинке Рекседа. Нейроны задних рогов, содержащие NO-синтазу, представляют собой мелкие (от 8×4 до 12×6 мкм), округлые, веретеновидные или треугольные клетки с яркоокрашенными цитоплазмой и отростками. Последние образуют сеть. В области Х пластинки Рекседа, окружающей центральный канал СМ, экспрессия NOS обнаруживается в цитоплазме большого количества нейронов, достигающих размеров 17×25 мкм, имеющих веретеновидную, реже звездчатую форму. Отростки этих клеток также дают позитивную иммуногистохимическую реакцию на NOS и имеют варикозности. Выявлены отдельные NOS-содержащие нейроны, локализующиеся в VII пластинке Рекседа. Эти клетки (от 22×11 до 27×13 мкм) имеют треугольную или звездчатую форму и толстые иммунопозитивные отростки. Интенсивность окраски цитоплазмы нейронов VII пластинки значительно слабее, чем клеток задних рогов и области центрального канала. При иммуногистохимическом выявлении NOS в шейном отделе СМ у взрослой крысы иммунопозитивные структуры были идентифицированы в его задних рогах, в области Х пластинки, а также на границе между VI и VII пластинками Рекседа. В задних рогах серого вещества СМ мелкие (до 12×9 мкм), веретеновидные NOS-содержащие клетки располагаются в I-III пластинках Рекседа. Более крупные (от 13×10 до19×12 мкм) нейроны с интенсивно окрашенной цитоплазмой локализуются в IV пластинке задних рогов. Это веретеновидные или овальные клетки, отростки которых также содержат NOS. Вокруг центрального канала СМ хорошо различимы нейроны с телами веретеновидной формы, в цитоплазме которых отчетливо выражена реакция на NOS. Отростки этих клеток также окрашены и образуют сеть. Наиболее крупные NOS-содержащие нейроны, тела которых достигают размеров 31×19 мкм, локализуются на границе между VI и VII пластинками Рекседа. В этой зоне серого вещества СМ иммунопозитивные клетки немногочисленны, имеют звездчатую форму и множество NOSсодержащих отростков. В настоящем исследовании при иммуногистохимическом выявлении ХАТ и NOS на серийных последовательных срезах СМ у взрослых крыс и новорожденных крысят выявлены несколько клеток, содержащих оба белка. У взрослых крыс такие коэкспрессирующие клетки обнаружены в области центрального серого вещества и на границе между VI и VII пластинками Рекседа. В шейном отделе СМ у новорожденных крысят клетки, синтезирующие ХАТ и NOS, располагаются в X пластинке, окружающей центральный канал (рис. 3). Обсуждение полученных данных. В настоящем исследовании при использовании селективного маркера холинергических нейронов - ХАТ - было установлено, что иммунопозитивные нейроны присутствуют как в задних, так и в передних рогах СМ, а также в центральном сером веществе. Иммуногистохимическая реакция на ХАТ позволила выявить крупные холинергические синапсы на мотонейронах - С-бутоны, обеспечивающие связь с холинергическими интернейронами центрального серого вещества [25], модулирующими двигательную активность мотонейронов. Данные синапсы были выявлены и на двигательных нейронах у новорожденных крысят. Проведенное исследование позволило установить, что нейроны моторных ядер передних рогов СМ у взрослых крыс имеют различную интенсивность окраски цитоплазмы. По-видимому, это свидетельствует о различной функциональной активности данных клеток. Физиологическими методами исследования СМ крыс было установлено, что как в норме, так и при патологии, функциональное состояние разных мотонейронов отличается. Известно, что синтезированная в перинуклеарной зоне нейрона ХАТ перераспределяется антероградным аксоплазматическим током по аксону [19]. Вероятно, уровень экспрессии фермента в перикарионе, обеспечивающий эффективную работу нервно-мышечных синапсов, не постоянен. В настоящем исследовании были выявлены особенности экспрессии ХАТ и в мотонейронах у новорожденных крысят. Оказалось, что эти нейроны имеют менее интенсивное окрашивание по сравнению с мотонейронами взрослых крыс и с нервными клетками других регионов СМ у новорожденных животных. Этот факт пока не имеет удовлетворительного физиологического объяснения. В задних рогах СМ нам удалось выявить ХАТ-содержащие волокна и отдельные холинергические клетки. Выявленные ХАТ-содержащие нервные волокна являются, вероятнее всего, аксонами нейронов чувствительного ганглия. ХАТэкспрессирующие клетки, описанные нами и локализованные во II-V пластинках заднего рога, являются, вероятно, холинергическими интернейронами, модулирующими болевые сигналы. Это предположение обосновано локализацией системы обработки болевых сигналов именно в I-V пластинках задних рогов СМ [11] и сведениями о том, что ацетилхолин в задних рогах является медиатором контроля боли [17, 20]. У новорожденных крысят в задних рогах СМ нам также удалось выявить ХАТ-содержащие волокна и отдельные холинергические клетки. Это свидетельствует о раннем формировании спинальной системы обработки сенсорной информации. В представленной работе установлено, что NOS-иммунопозитивные нейроны отсутствуют в передних рогах СМ. Основные зоны иммунореактивности локализуются в задних рогах, промежуточном и центральном сером веществе. Особый интерес представляет X пластинка Рекседа, окружающая центральный канал. Ряд работ убедительно доказывают, что данная область представляет собой пролиферативную зону СМ у взрослых крыс [8], аналогичную пролиферативным зонам головного мозга [4]. Известно, что NO в процессе нейроногенеза стимулирует переход клеток от пролиферации к дифференцировке [12, 14]. Так, в субвентрикулярной зоне головного мозга у взрослой мыши NO синтезируется нейронами в непосредственной близости от клетокпредшественников и участвует в постнатальном нейрогенезе [18]. Можно предположить, что выявленные в настоящем исследовании NO-ергические нейроны вблизи центрального канала участвуют в регуляции постнатального нейроногенеза в СМ. Это подтверждает также тот факт, что NOSиммунопозитивные клетки присутствуют в центральном сером веществе уже у новорожденных крыс. Функция NO в СМ недостаточно ясна. Можно предположить, что NO участвует в регуляции местного кровотока, как это показано в головном мозгу. Также NO может участвовать в спинальной обработке болевых сигналов [16]. В данном исследовании NOS-экспрессирующие интернейроны, которые могут участвовать в модуляции болевых сигналов, были выявлены в задних рогах СМ у взрослых и новорожденных крыс. В настоящей работе при сопоставлении на последовательных срезах реакции на NOS и ХАТ была обнаружена совместная локализация этих ферментов в цитоплазме отдельных нейронов. Возможность синтеза нескольких различных нейромедиаторов одной клеткой в настоящее время убедительно доказана в работах зарубежных и отечественных авторов [1, 13, 22]. Показано, что в ЦНС NO может экспрессироваться в нейронах различной медиаторной принадлежности. Так, присутствие NO описано в некоторых катехоламинергических нейронах продолговатого мозга у рыб [7], а также в холинергических нейронах головного мозга кошки [22]. Отдельные нейроны СМ, предположительно синтезирующие одновременно ацетилхолин и NO, были описаны ранее у взрослых крыс [24]. Однако для выявления активности NOS в этой работе был использован менее специфичный гистохимический метод. Относительно формирования таких нейронов в онтогенезе имеется лишь одно исследование, выполненное с применением гистохимических методов выявления NADPH-диафоразы и АЦХ-эстеразы [9]. В этой работе авторы описывают распределение АЦХ-эстеразо-и NADPH-диафоразо-позитивных клеток в разные сроки после рождения, однако им не удалось выявить нейроны, содержащие одновременно два фермента. Наше исследование позволило дополнить данные о совместной локализации ХАТ и NOS как у взрослых крыс, так и у новорожденных животных. Относительно специфики холинергических нейронов, экспрессирующих NOS, нет однозначных данных. Существует предположение, что NO-синтаза в таких клетках играет протективную роль [24]. По-видимому, на определенных этапах онтогенеза в Х пластинке Рекседа и на границе VI и VII пластинок располагаются нейроны, нуждающиеся в повышенной устойчивости к повреждению. По мнению некоторых авторов, экспрессия NO-синтазы холинергическими нейронами способствует NO-ергической модуляции выделения АЦХ [13]. Таким образом, в настоящем исследовании получены ранее неизвестные факты о распределении NOS-и ХАТ-содержащих нейронов СМ. Установлена совместная локализация двух ферментов в отдельных нейронах СМ как у взрослых крыс, так и у новорожденных животных. Обнаружение клеток, содержащих оба медиатора, уже в 1-е сутки после рождения позволяет предполагать, что это особая субпопуляция холинергических нейронов, которая формируется в СМ крысы в пренатальном онтогенезе.

Об авторах

Елена Андреевна Колос

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Email: iemmorphol@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы, отдел общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы