ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ УДЛИНЕНИИ ГОЛЕНИ МЕТОДОМ ЧРЕСКОСТНОГО ДИСТРАКЦИОННОГО ОСТЕОСИНТЕЗА ПРИ ПОВЫШЕННОМ СУТОЧНОМ ТЕМПЕ

Полный текст

Укорочение конечностей остается одним из распространенных видов ортопедической патологии, не имеющей тенденции к снижению [7]. В современной ортопедии задача коррекции длины сегмента конечности решается хирургическими средствами, в том числе методом дистракционного остеосинтеза, разработанным акад. Г. А. Илизаровым. В поддержании активного остеогенеза и адекватного кровоснабжения в процессе дистракционного остеосинтеза определенную роль играют такие механические факторы, как темп и дробность дистракции [3, 10]. Высокий уровень костеобразования при дистракции возможен лишь при суточном темпе, не превышающем скорость новообразования костной ткани [11, 12]. В условиях круглосуточной высокодробной дистракции адаптационно-репаративные процессы в тканях удлиняемой конечности протекают более благоприятно [8-10]. Однако избыточно дробная дистракция при удлинении сегмента конечности может приводить к преждевременной оссификации соединительнотканной прослойки, что делает дальнейшее удлинение проблематичным [5]. В настоящее время изучен процесс дистракционного остеогенеза большеберцовой кости при удлинении голени с темпом 3 мм за 180 приемов [1, 6]. В данном эксперименте по окончании периода фиксации в области между отломками отмечено формирование новообразованного опороспособного участка диафиза гиперпластического типа с избыточным содержанием периостально образованной костной ткани. Мы предположили, что незначительное снижение дробности до 120 приемов в сутки с тем же суточным темпом (3 мм) позволит создать более оптимальные условия для остеогенеза. Цель настоящего исследования - изучение развития костной ткани в условиях удлинения голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов методом чрескостного дистракционного остеосинтеза с применением автоприводов. Материал и методы. Эксперименты выполнены на 15 взрослых беспородных собаках, которым под тиопенталовым наркозом в условиях операционной осуществляли флексионную остеоклазию берцовых костей и через 5 сут производили удлинение голени аппаратом Илизарова с автоматическим приводом, обеспечивающим темп 3 мм/сут за 120 приемов. Средняя величина удлинения составила 15%. Собак выводили из опыта передозировкой барбитуратов через 5, 10 сут дистракции, 30 сут фиксации и 30 сут после снятия аппарата. В качестве контроля изучали большеберцовую кость 10 взрослых интактных беспородных собак. Содержание, операции и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утверждённых приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г. и Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996 г.). Распилы регенератов диафизов большеберцовых костей и фрагменты (объемом 1-2 мм3), выпиленные из их различных зон, фиксировали в смеси 2% растворов параформ-и глутаральдегидов с добавлением фосфатного буфера (рН 7,4), после чего часть кусочков обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (от 70 до 100%), безводном ацетоне и заливали в аралдит, а часть - декальцинировали трилоном Б, дегидратировали и заливали в целлоидин либо парафин. Гистотопографические целлоидиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином, по методу Массона, по ВанГизону, ставили ШИК-реакцию и изучали при помощи светового фотомикроскопа Photomicroscope III (Opton, Германия). Пролиферативную активность остеогенных клеток оценивали на парафиновых срезах костной ткани путем визуализации антигена Ki67 стрептавидин-биотиновым методом (Novocastra, Великобритания). На оцифрованных изображениях полутонких препаратов, окрашенных метиленовым синим с постановкой ШИКреакции при помощи программы-анализатора изображений «ВидеоТесТ-Морфология 4.0» (Россия), определяли следующие параметры: площадь клеток остеобластического дифферона, фактор формы клеток, их ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО). Ввод изображений в память компьютера выполняли с использованием аппаратно-программного комплекса «ДиаМорф» (Россия). Соотношение доли клеток в различных зонах регенерата определяли, исходя из предварительных значений численной плотности каждого типа клеток в поле зрения микроскопа при общем увеличении 640. Поверхности распилов дистракционных регенератов диафизов большеберцовых костей, залитых в аралдит, отполированные мелкоабразивными материалами, и поверхности блоков после изготовления полутонких срезов напыляли тонким слоем платины в ионном напылителе IB-6 (EIKO, Япония) и изучали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония). Содержание кальция и фосфора в различных зонах дистракционных регенератов определяли, используя рентгенов 25 20 15 10 5 0 ский электронно-зондовый микроанализатор INKA Energy 200 (Oxford Instrumets Analytical, Великобритания) в весовых процентах (вес.%). Вычисляли их соотношение (Са/Р) путем деления весовой концентрации Са на весовую концентрацию Р. Статистическую обработку количественных данных проводили с помощью пакета анализа данных приложения «Microsoft Exel» программного продукта «Microsoft Office». Значимость различий средних показателей оценивали при помощи двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями. Результаты исследования. Выявлено, что через 5 сут дистракции между отломками образовывалась продольно ориентированная рыхлая волокнистая соединительная ткань с умеренным содержанием сосудов микроциркуляторного русла. Со стороны проксимального костного отломка проходило формирование тяжей эндостально образованных костных трабекул. В области проксимального и дистального костных отломков выявлялась слабая периостальная реакция. Интенсивность ШИК-реакции в регенерате была очень слабой, но варьировала, усиливаясь по мере удаления от срединной части регенерата к отломкам. Среднее содержание Са в области прослойки составило 0,91±0,20 вес.%, в области проксимального и дистального костных отделов - 1,0±0,3 и 3,3±1,1 вес.% соответственно (рис. 1). При этом, соотношение Са/Р составляло 0,96±0,03. Клеточный состав интермедиарной зоны диастаза был представлен, преимущественно, малодифференцированными фибробластоподобными клетками (42,4±1,9%), небольшой долей остеобластов (7,8±1,2%), эндотелиоцитами формирующихся капилляров (18,8±0,7%), моноцитами и костными макрофагами - остеокластами (9,7±0,3%), тучными клетками (5,8±1,7%) и клетками крови (в среднем 16%). При анализе ЯЦО клеток остеобластического дифферона выявлено резкое (в 6,4 раза) уменьшение доли дифференцированных клеток с ЯЦО менее 0,5 (P<0,01), преобладающих в дифференцированной пластинчатой костной ткани коркового вещества большеберцовой кости у интактных собак. При этом, появлялись клетки с ЯЦО от 0,8 до 2 (в сумме до 66,25%), отсутствующие у контрольных животных. Клетки, значения ЯЦО которых соответствовали 0,5-0,8 (функционально активные), составляли приблизительно такую же долю, как и в контроле (P≥0,05) (рис. 2). При этом, средние значения фактора формы клеток были приближены к форме круга (рис. 3), что также указывало на преобладание в диффероне малодифференцированных клеток. Через 10 сут дистракции в диастазе был обнаружен регенерат с формирующимися, преимущественно в эндостальной и интермедиарной областях, костными трабекулами, представленными слабоминерализованной костной тканью и соединительнотканной прослойкой высотой 5-10 мм (рис. 4, а), в которой выявлялись малодифференцированные фибробластоподобные клетки (см. рис. 4, б), и происходил активный неоваскулогенез. Иммуногистохимическая реакция на маркер пролиферации Ki67 была наиболее выражена в клетках соединительнотканной прослойки (см. рис. 4, г) и надкостницы, прилегающей к этой области регенерата. Мечение отдельных клеток Кi67 наблюдали и в костных отделах регенерата. Коллагеновые волокна в соединительнотканной прослойке были вытянуты вдоль вектора растяжения, плотно прилегали друг к другу (см. рис. 4, в) и при ШИК-реакции окрашивались интенсивнее, чем в предыдущий период. Содержание Са в этой области составило 1,22±0,03 вес.% при соотношении Са/Р - 1,150±0,020, характерном для аморфной формы фосфата кальция (см. рис. 1). Костные отделы, формирующиеся в результате эндостального остеогенеза проксимальнее и дистальнее соединительнотканной прослойки, были представлены продольно ориентированной сетью трабекул, которые имели игольчатую или зубчатую форму. Матрикс костных трабекул был слабо ШИК-положителен, что свидетельствовало о низкой степени его минерализации. Остеогенные клетки имели крупные размеры (таблица) и ядро, занимающее большую часть клетки, что указывало на начальные этапы их остеогенной дифференцировки и подтверждалось наличием делящихся клеток. Процесс костеобразования был отмечен и в интермедиарной зоне со стороны костных отломков. Содержание Са в проксимальном костном отделе составило 5,5±0,3 вес.%, в дистальном - 6,50±0,20 вес.% (отношение Са/Р, соответственно, составляло 1,60±0,04 и 1,43±0,05). Со стороны отломков кости наблюдали незначительную эндостальную и периостальную реакцию в виде тонких вытянутых в область диастаза тяжей грубоволокнистой костной ткани (см. рис. 4, а). При оценке относительного содержания клеток (см. рис. 2) в зоне прослойки выявлено сохранение доли малодифференцированных фибробластоподобных клеток (43,1±1,9%) (P≥0,05), увеличение доли остеобластов (15,8±0,6%) и эндотелиоцитов (24,7±0,9%) (P<0,01). Долевое распределение клеток в проксимальном и дистальном костных отделах было примерно однотипным, при незначительном преобладании остеогенных клеток в проксимальном отломке (P<0,05): фибробластоподобные клетки - 13,7±0,5 и 15,9±0,6%, остеобласты - 55,8±1,9 и 49,0±0,9%, эндотелиоциты - 16,1±0,6 и 14,4±0,7%, клетки моноцитарно-макрофагального дифферона - 6,30±0,29 и 5,30±0,23%, тучные клетки - 9,6±0,3 и 8,90±0,21%. В интермедиарной зоне регенерата относительное содержание малодифференцированных клеток с ЯЦО от 0,8 до 1 и более 1 снизилось, в среднем, на 38,25% и составляло около 18% (см. рис. 2). При этом, на 12% увеличилась доля дифференцированных функционально активных клеток с ЯЦО 0,5-0,7. Содержание клеток с показателем до 0,5 возросло на 33,5%, что на 34% оставалось ниже, чем в контроле. Изменение фактора формы клеток в сторону эллипса (среднее значение 0,56) свидетельствовало о большей дифференцированности клеток, чем в предыдущем периоде. К 30-м суткам фиксации область между отломками теряла зональное строение и была представлена эндостальным костным регенератом трабекулярного строения (рис. 5, а). Со стороны периоста было отмечено образование узкого непрерывного слоя мелкопетлистого губчатого вещества кости, формирующего корковую пластинку. Содержание Са в срединной части регенерата на месте бывшей соединительнотканной прослойки составило 11,4±0,20 вес.%, в области, приближенной к проксимальному отломку, - 13,2±1,4 вес.%, к дистальному - 14,3±1,1 вес.% (см. рис. 2). При этом, соотношение Са и Р не имело зональных различий и составляло 1,90±0,08, что свидетельствовало о формировании в этих зонах кристаллической формы фосфата кальция. Во всех исследованных участках преобладали клетки остеобластического дифферона (см. рис. 5, б). В этот период возрастала доля остеобластов (57,0±2,6%), остеоцитов (21,1±0,9%) и остеокластов (11,2±0,4%), при снижении доли эндотелиоцитов (12,8±0,6) (P<0,01), что связано с органотипической перестройкой костных структур и сосудистого русла, начинающейся в этот период. О преобладании в регенерате дифференцированных клеток (до 93,3%) свидетельствовали показатели ЯЦО, характерные для остеоцитов и остеобластов. Фактор формы клеток приближался к таковому в контроле (см. рис. 3). Увеличение среднего показателя площади остеогенных клеток (см. таблицу) объясняется усилением их биосинтетической функции. Однако некоторые остеобласты, обнаруживавшиеся на поверхности костных трабекул, сохраняли и пролиферативную активность, о чем свидетельствовала визуализация Ki67 в отдельных клетках (см. рис. 5, в). Через 30 сут после снятия аппарата на гистотопограммах было видно формирование корковой пластинки компактного строения и костномозговой полости, содержащей костный мозг (см. рис. 5, г). Однако в срединной части этой зоны наблюдалось незначительное содержание резорбирующихся костных трабекул, а эндостальная поверхность новообразованной корковой пластинки еще не достигала полного органотипического строения. Содержание Са в различных участках новообразованного диафиза не имело значимых отличий (P≥0,05), составляя, в среднем, 17,2±1,0 вес.% и приближаясь к показателям у интактных животных - 21,0±1,3 вес.% (см. рис. 1). Отношение Са/Р соответствовало кристаллической форме гидроксиапатита у интактных собак и составляло 2,10±0,09. О приближении строения регенерата в этот период к органотипичному свидетельствовало преобладание в интермедиарной зоне регенерата дифференцированных остеогенных клеток - остеобластов (52,0±1,9%), что подтверждалось показателями фактора формы (см. рис. 3), ЯЦО (см. рис. 2) и площади клеток (см. таблицу). Наблюдались значимое увеличение доли остеоцитов (31,0±1,2%, P<0,05) и уменьшение доли остеокластов (7,1±0,3%, P<0,05). Однако имелась значимая разница в соотношении клеточного состава в новообразованной и интактной кости (P<0,01) (остеобласты - 15,10±0,20%, остеоциты - 77,9±2,2%, эндотелиоциты - 7,0±0,28%). Обсуждение полученных данных. При автоматическом удлинении голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов в период дистракции малодифференцированные фибробластоподобные клетки срединной прослойки регенерата диафиза большеберцовой кости обладают остеогенной потенцией, более выраженной к окончанию этого периода. Об этом свидетельствует ШИКположительное окрашивание межклеточного вещества прослойки, специфичное для сиалогликопротеинов, участвующих в процессе минерализации формирующегося костного матрикса [4, 14, 15]. Показатели ЯЦО, фактора формы и площади клеток, низкое содержание остеотропных химических элементов в межклеточном матриксе подтверждают преобладание в регенерате к середине периода дистракции малодифференцированных клеток, которые к его окончанию дифференцируются в преостеобласты и в области костных отделов - в остеобласты. Этот факт объясняет быстрое формирование эндостального костного регенерата как и при режиме 3 мм за 180 приемов [6] уже к 30-м суткам фиксации. Однако в отличие от предыдущих исследований [1, 6] снижение дробности до 120 мм создает условия для формирования регенерата нормотрофического типа. Это свидетельствует об оптимальном соответствии скорости (3 мм/сут) и дробности (120 приемов) для обеспечения остеогенеза в диастазе удлиняемой кости. С увеличением периода эксперимента пролиферативная активность остеогенных клеток снижается, а биосинтетическая - увеличивается, что объясняется большей дифференцированностью клеток и активизацией синтеза ими костного матрикса. В диастазе формируется значительное количество капилляров, что подтверждается большой долей эндотелиоцитов в периоды дистракции и фиксации. Это способствует хорошей оксигенации тканей регенерата. Периваскулярные клетки, располагающиеся по ходу сосудов, также являются одним из источников остеобластов, участвующих в минерализации коллагеновых волокон прослойки [2, 4]. Формирование новообразованной костной ткани в дистракционном регенерате осуществляется только по интрамембранозному пути, что обеспечивается высокой дробностью дистракции и достаточностью кровоснабжения. В исследованиях других авторов при увеличении темпа до 3 мм с низкой дробностью отмечается как интрамембранозный, так и эндохондральный остеогенез [13]. При формировании костного регенерата на ранних этапах наблюдается наибольшая выраженность внутри-и междифферонной клеточной гетероморфии, отражающей фазность процесса регенерации и способствующей образованию провизорных костных структур эндостального генеза, обеспечивающих к 30-м суткам фиксации опороспособность новообразованного участка кости. В постдистракционный период происходит ослабление клеточной гетероморфии и преобладание клеток остеобластического дифферона, участвующих в формировании новообразованного участка кости, строение которого через 30 сут после снятия аппарата (75 сут после операции) приближается к органоспецифичному. Таким образом, в условиях удлинения голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов новообразованный опороспособный участок диафиза формируется через 45 сут после операции, а через 75 сут эксперимента он приобретает органотипическое строение. Полученные результаты свидетельствуют о пластичности костной ткани, что в условиях высокодробной автоматической дистракции позволяет увеличить суточный темп до 3 мм и сократить аппаратный период удлинения голени на 31% по сравнению с классической методикой, когда суточный темп не превышает 1 мм.

Об авторах

Елена Николаевна Горбач

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

Email: gorbach.e@mail.ru
лаборатория морфологии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Михаил Александрович Степанов

Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова

лаборатория морфологии 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы