PECULIARITIES OF BONE TISSUE MORPHOGENESIS DURING SHIN LENGTHENING USING THE METHOD OF TRANSOSSEOUS DISTRACTION OSTEOSYNTHESIS WITH THE INCREASED DAILY RATE

Full Text

Укорочение конечностей остается одним из распространенных видов ортопедической патологии, не имеющей тенденции к снижению [7]. В современной ортопедии задача коррекции длины сегмента конечности решается хирургическими средствами, в том числе методом дистракционного остеосинтеза, разработанным акад. Г. А. Илизаровым. В поддержании активного остеогенеза и адекватного кровоснабжения в процессе дистракционного остеосинтеза определенную роль играют такие механические факторы, как темп и дробность дистракции [3, 10]. Высокий уровень костеобразования при дистракции возможен лишь при суточном темпе, не превышающем скорость новообразования костной ткани [11, 12]. В условиях круглосуточной высокодробной дистракции адаптационно-репаративные процессы в тканях удлиняемой конечности протекают более благоприятно [8-10]. Однако избыточно дробная дистракция при удлинении сегмента конечности может приводить к преждевременной оссификации соединительнотканной прослойки, что делает дальнейшее удлинение проблематичным [5]. В настоящее время изучен процесс дистракционного остеогенеза большеберцовой кости при удлинении голени с темпом 3 мм за 180 приемов [1, 6]. В данном эксперименте по окончании периода фиксации в области между отломками отмечено формирование новообразованного опороспособного участка диафиза гиперпластического типа с избыточным содержанием периостально образованной костной ткани. Мы предположили, что незначительное снижение дробности до 120 приемов в сутки с тем же суточным темпом (3 мм) позволит создать более оптимальные условия для остеогенеза. Цель настоящего исследования - изучение развития костной ткани в условиях удлинения голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов методом чрескостного дистракционного остеосинтеза с применением автоприводов. Материал и методы. Эксперименты выполнены на 15 взрослых беспородных собаках, которым под тиопенталовым наркозом в условиях операционной осуществляли флексионную остеоклазию берцовых костей и через 5 сут производили удлинение голени аппаратом Илизарова с автоматическим приводом, обеспечивающим темп 3 мм/сут за 120 приемов. Средняя величина удлинения составила 15%. Собак выводили из опыта передозировкой барбитуратов через 5, 10 сут дистракции, 30 сут фиксации и 30 сут после снятия аппарата. В качестве контроля изучали большеберцовую кость 10 взрослых интактных беспородных собак. Содержание, операции и эвтаназию животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утверждённых приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г. и Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996 г.). Распилы регенератов диафизов большеберцовых костей и фрагменты (объемом 1-2 мм3), выпиленные из их различных зон, фиксировали в смеси 2% растворов параформ-и глутаральдегидов с добавлением фосфатного буфера (рН 7,4), после чего часть кусочков обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (от 70 до 100%), безводном ацетоне и заливали в аралдит, а часть - декальцинировали трилоном Б, дегидратировали и заливали в целлоидин либо парафин. Гистотопографические целлоидиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином, по методу Массона, по ВанГизону, ставили ШИК-реакцию и изучали при помощи светового фотомикроскопа Photomicroscope III (Opton, Германия). Пролиферативную активность остеогенных клеток оценивали на парафиновых срезах костной ткани путем визуализации антигена Ki67 стрептавидин-биотиновым методом (Novocastra, Великобритания). На оцифрованных изображениях полутонких препаратов, окрашенных метиленовым синим с постановкой ШИКреакции при помощи программы-анализатора изображений «ВидеоТесТ-Морфология 4.0» (Россия), определяли следующие параметры: площадь клеток остеобластического дифферона, фактор формы клеток, их ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО). Ввод изображений в память компьютера выполняли с использованием аппаратно-программного комплекса «ДиаМорф» (Россия). Соотношение доли клеток в различных зонах регенерата определяли, исходя из предварительных значений численной плотности каждого типа клеток в поле зрения микроскопа при общем увеличении 640. Поверхности распилов дистракционных регенератов диафизов большеберцовых костей, залитых в аралдит, отполированные мелкоабразивными материалами, и поверхности блоков после изготовления полутонких срезов напыляли тонким слоем платины в ионном напылителе IB-6 (EIKO, Япония) и изучали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Jeol, Япония). Содержание кальция и фосфора в различных зонах дистракционных регенератов определяли, используя рентгенов 25 20 15 10 5 0 ский электронно-зондовый микроанализатор INKA Energy 200 (Oxford Instrumets Analytical, Великобритания) в весовых процентах (вес.%). Вычисляли их соотношение (Са/Р) путем деления весовой концентрации Са на весовую концентрацию Р. Статистическую обработку количественных данных проводили с помощью пакета анализа данных приложения «Microsoft Exel» программного продукта «Microsoft Office». Значимость различий средних показателей оценивали при помощи двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями. Результаты исследования. Выявлено, что через 5 сут дистракции между отломками образовывалась продольно ориентированная рыхлая волокнистая соединительная ткань с умеренным содержанием сосудов микроциркуляторного русла. Со стороны проксимального костного отломка проходило формирование тяжей эндостально образованных костных трабекул. В области проксимального и дистального костных отломков выявлялась слабая периостальная реакция. Интенсивность ШИК-реакции в регенерате была очень слабой, но варьировала, усиливаясь по мере удаления от срединной части регенерата к отломкам. Среднее содержание Са в области прослойки составило 0,91±0,20 вес.%, в области проксимального и дистального костных отделов - 1,0±0,3 и 3,3±1,1 вес.% соответственно (рис. 1). При этом, соотношение Са/Р составляло 0,96±0,03. Клеточный состав интермедиарной зоны диастаза был представлен, преимущественно, малодифференцированными фибробластоподобными клетками (42,4±1,9%), небольшой долей остеобластов (7,8±1,2%), эндотелиоцитами формирующихся капилляров (18,8±0,7%), моноцитами и костными макрофагами - остеокластами (9,7±0,3%), тучными клетками (5,8±1,7%) и клетками крови (в среднем 16%). При анализе ЯЦО клеток остеобластического дифферона выявлено резкое (в 6,4 раза) уменьшение доли дифференцированных клеток с ЯЦО менее 0,5 (P<0,01), преобладающих в дифференцированной пластинчатой костной ткани коркового вещества большеберцовой кости у интактных собак. При этом, появлялись клетки с ЯЦО от 0,8 до 2 (в сумме до 66,25%), отсутствующие у контрольных животных. Клетки, значения ЯЦО которых соответствовали 0,5-0,8 (функционально активные), составляли приблизительно такую же долю, как и в контроле (P≥0,05) (рис. 2). При этом, средние значения фактора формы клеток были приближены к форме круга (рис. 3), что также указывало на преобладание в диффероне малодифференцированных клеток. Через 10 сут дистракции в диастазе был обнаружен регенерат с формирующимися, преимущественно в эндостальной и интермедиарной областях, костными трабекулами, представленными слабоминерализованной костной тканью и соединительнотканной прослойкой высотой 5-10 мм (рис. 4, а), в которой выявлялись малодифференцированные фибробластоподобные клетки (см. рис. 4, б), и происходил активный неоваскулогенез. Иммуногистохимическая реакция на маркер пролиферации Ki67 была наиболее выражена в клетках соединительнотканной прослойки (см. рис. 4, г) и надкостницы, прилегающей к этой области регенерата. Мечение отдельных клеток Кi67 наблюдали и в костных отделах регенерата. Коллагеновые волокна в соединительнотканной прослойке были вытянуты вдоль вектора растяжения, плотно прилегали друг к другу (см. рис. 4, в) и при ШИК-реакции окрашивались интенсивнее, чем в предыдущий период. Содержание Са в этой области составило 1,22±0,03 вес.% при соотношении Са/Р - 1,150±0,020, характерном для аморфной формы фосфата кальция (см. рис. 1). Костные отделы, формирующиеся в результате эндостального остеогенеза проксимальнее и дистальнее соединительнотканной прослойки, были представлены продольно ориентированной сетью трабекул, которые имели игольчатую или зубчатую форму. Матрикс костных трабекул был слабо ШИК-положителен, что свидетельствовало о низкой степени его минерализации. Остеогенные клетки имели крупные размеры (таблица) и ядро, занимающее большую часть клетки, что указывало на начальные этапы их остеогенной дифференцировки и подтверждалось наличием делящихся клеток. Процесс костеобразования был отмечен и в интермедиарной зоне со стороны костных отломков. Содержание Са в проксимальном костном отделе составило 5,5±0,3 вес.%, в дистальном - 6,50±0,20 вес.% (отношение Са/Р, соответственно, составляло 1,60±0,04 и 1,43±0,05). Со стороны отломков кости наблюдали незначительную эндостальную и периостальную реакцию в виде тонких вытянутых в область диастаза тяжей грубоволокнистой костной ткани (см. рис. 4, а). При оценке относительного содержания клеток (см. рис. 2) в зоне прослойки выявлено сохранение доли малодифференцированных фибробластоподобных клеток (43,1±1,9%) (P≥0,05), увеличение доли остеобластов (15,8±0,6%) и эндотелиоцитов (24,7±0,9%) (P<0,01). Долевое распределение клеток в проксимальном и дистальном костных отделах было примерно однотипным, при незначительном преобладании остеогенных клеток в проксимальном отломке (P<0,05): фибробластоподобные клетки - 13,7±0,5 и 15,9±0,6%, остеобласты - 55,8±1,9 и 49,0±0,9%, эндотелиоциты - 16,1±0,6 и 14,4±0,7%, клетки моноцитарно-макрофагального дифферона - 6,30±0,29 и 5,30±0,23%, тучные клетки - 9,6±0,3 и 8,90±0,21%. В интермедиарной зоне регенерата относительное содержание малодифференцированных клеток с ЯЦО от 0,8 до 1 и более 1 снизилось, в среднем, на 38,25% и составляло около 18% (см. рис. 2). При этом, на 12% увеличилась доля дифференцированных функционально активных клеток с ЯЦО 0,5-0,7. Содержание клеток с показателем до 0,5 возросло на 33,5%, что на 34% оставалось ниже, чем в контроле. Изменение фактора формы клеток в сторону эллипса (среднее значение 0,56) свидетельствовало о большей дифференцированности клеток, чем в предыдущем периоде. К 30-м суткам фиксации область между отломками теряла зональное строение и была представлена эндостальным костным регенератом трабекулярного строения (рис. 5, а). Со стороны периоста было отмечено образование узкого непрерывного слоя мелкопетлистого губчатого вещества кости, формирующего корковую пластинку. Содержание Са в срединной части регенерата на месте бывшей соединительнотканной прослойки составило 11,4±0,20 вес.%, в области, приближенной к проксимальному отломку, - 13,2±1,4 вес.%, к дистальному - 14,3±1,1 вес.% (см. рис. 2). При этом, соотношение Са и Р не имело зональных различий и составляло 1,90±0,08, что свидетельствовало о формировании в этих зонах кристаллической формы фосфата кальция. Во всех исследованных участках преобладали клетки остеобластического дифферона (см. рис. 5, б). В этот период возрастала доля остеобластов (57,0±2,6%), остеоцитов (21,1±0,9%) и остеокластов (11,2±0,4%), при снижении доли эндотелиоцитов (12,8±0,6) (P<0,01), что связано с органотипической перестройкой костных структур и сосудистого русла, начинающейся в этот период. О преобладании в регенерате дифференцированных клеток (до 93,3%) свидетельствовали показатели ЯЦО, характерные для остеоцитов и остеобластов. Фактор формы клеток приближался к таковому в контроле (см. рис. 3). Увеличение среднего показателя площади остеогенных клеток (см. таблицу) объясняется усилением их биосинтетической функции. Однако некоторые остеобласты, обнаруживавшиеся на поверхности костных трабекул, сохраняли и пролиферативную активность, о чем свидетельствовала визуализация Ki67 в отдельных клетках (см. рис. 5, в). Через 30 сут после снятия аппарата на гистотопограммах было видно формирование корковой пластинки компактного строения и костномозговой полости, содержащей костный мозг (см. рис. 5, г). Однако в срединной части этой зоны наблюдалось незначительное содержание резорбирующихся костных трабекул, а эндостальная поверхность новообразованной корковой пластинки еще не достигала полного органотипического строения. Содержание Са в различных участках новообразованного диафиза не имело значимых отличий (P≥0,05), составляя, в среднем, 17,2±1,0 вес.% и приближаясь к показателям у интактных животных - 21,0±1,3 вес.% (см. рис. 1). Отношение Са/Р соответствовало кристаллической форме гидроксиапатита у интактных собак и составляло 2,10±0,09. О приближении строения регенерата в этот период к органотипичному свидетельствовало преобладание в интермедиарной зоне регенерата дифференцированных остеогенных клеток - остеобластов (52,0±1,9%), что подтверждалось показателями фактора формы (см. рис. 3), ЯЦО (см. рис. 2) и площади клеток (см. таблицу). Наблюдались значимое увеличение доли остеоцитов (31,0±1,2%, P<0,05) и уменьшение доли остеокластов (7,1±0,3%, P<0,05). Однако имелась значимая разница в соотношении клеточного состава в новообразованной и интактной кости (P<0,01) (остеобласты - 15,10±0,20%, остеоциты - 77,9±2,2%, эндотелиоциты - 7,0±0,28%). Обсуждение полученных данных. При автоматическом удлинении голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов в период дистракции малодифференцированные фибробластоподобные клетки срединной прослойки регенерата диафиза большеберцовой кости обладают остеогенной потенцией, более выраженной к окончанию этого периода. Об этом свидетельствует ШИКположительное окрашивание межклеточного вещества прослойки, специфичное для сиалогликопротеинов, участвующих в процессе минерализации формирующегося костного матрикса [4, 14, 15]. Показатели ЯЦО, фактора формы и площади клеток, низкое содержание остеотропных химических элементов в межклеточном матриксе подтверждают преобладание в регенерате к середине периода дистракции малодифференцированных клеток, которые к его окончанию дифференцируются в преостеобласты и в области костных отделов - в остеобласты. Этот факт объясняет быстрое формирование эндостального костного регенерата как и при режиме 3 мм за 180 приемов [6] уже к 30-м суткам фиксации. Однако в отличие от предыдущих исследований [1, 6] снижение дробности до 120 мм создает условия для формирования регенерата нормотрофического типа. Это свидетельствует об оптимальном соответствии скорости (3 мм/сут) и дробности (120 приемов) для обеспечения остеогенеза в диастазе удлиняемой кости. С увеличением периода эксперимента пролиферативная активность остеогенных клеток снижается, а биосинтетическая - увеличивается, что объясняется большей дифференцированностью клеток и активизацией синтеза ими костного матрикса. В диастазе формируется значительное количество капилляров, что подтверждается большой долей эндотелиоцитов в периоды дистракции и фиксации. Это способствует хорошей оксигенации тканей регенерата. Периваскулярные клетки, располагающиеся по ходу сосудов, также являются одним из источников остеобластов, участвующих в минерализации коллагеновых волокон прослойки [2, 4]. Формирование новообразованной костной ткани в дистракционном регенерате осуществляется только по интрамембранозному пути, что обеспечивается высокой дробностью дистракции и достаточностью кровоснабжения. В исследованиях других авторов при увеличении темпа до 3 мм с низкой дробностью отмечается как интрамембранозный, так и эндохондральный остеогенез [13]. При формировании костного регенерата на ранних этапах наблюдается наибольшая выраженность внутри-и междифферонной клеточной гетероморфии, отражающей фазность процесса регенерации и способствующей образованию провизорных костных структур эндостального генеза, обеспечивающих к 30-м суткам фиксации опороспособность новообразованного участка кости. В постдистракционный период происходит ослабление клеточной гетероморфии и преобладание клеток остеобластического дифферона, участвующих в формировании новообразованного участка кости, строение которого через 30 сут после снятия аппарата (75 сут после операции) приближается к органоспецифичному. Таким образом, в условиях удлинения голени с суточным темпом 3 мм за 120 приемов новообразованный опороспособный участок диафиза формируется через 45 сут после операции, а через 75 сут эксперимента он приобретает органотипическое строение. Полученные результаты свидетельствуют о пластичности костной ткани, что в условиях высокодробной автоматической дистракции позволяет увеличить суточный темп до 3 мм и сократить аппаратный период удлинения голени на 31% по сравнению с классической методикой, когда суточный темп не превышает 1 мм.

About the authors

Ye. N. Gorbach

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopaedics

Email: gorbach.e@mail.ru
Laboratory of Morphology

M. A. Stepanov

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopaedics

Laboratory of Morphology

References

Supplementary files