АНГИОГЕНЕЗ В ТКАНЯХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОМОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ РЯДОМ С ТРОМБИРОВАННОЙ ВЕНОЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Полный текст

В настоящее время наблюдается увеличе-тромба, быстрая реканализация вены и восстание числа больных с сосудистыми тромбозами новление кровообращения в ишемизированных [3], при этом успех репаративных процессов во в результате тромбоза тканях были достигнуты многом определяется развитием коллатерально-в экспериментальных моделях с проангиогенными го кровотока и реканализацией самого тромба. агентами [5, 7, 10, 13, 14, 17]. Анализ причин неудачного лечения таких больных Методами люминесцентной микроскопии изусвидетельствует о том, что для их преодоления чали результаты введения аутологичных мультинеобходимо как усовершенствование технологии потентных стромальных (мезенхимальных) ствомедикаментозного и хирургического лечения, так ловых клеток костномозгового происхождения и создание оптимальных условий для восстановле-(АССККП) с геном зеленого флюоресцентного ния кровотока. белка (GFP) в тромбированную вену задней конеч Красный костный мозг содержит прогени-ности крыс. Было обнаружено, что восстановлеторные клетки, способные к дифференциров-ние кровотока в тромбированной магистральной ке в эндотелиоциты и перициты. Это позволяет вене всегда идет за счет тромболизиса. Признаков широко применять такие клетки для ускорения встраивания введенных АССККП в стенку тромреваскуляризации тканей с нарушенной микро-бированного сосуда, реканализации тромба и форциркуляцией [6, 7, 9, 11, 12, 17]. Реваскуляризация мирования коллатералей обнаружено не было [1]. При моделировании тромбоза в эксперименте введением тромбина и лигированием магистральной вены также происходит тромбирование ее мелких ветвей, где восстановление кровотока происходит или путем реканализации тромба или прорастания новых. АССККП участвуют в обоих этих процессах, что приводит к более быстрому восстановлению кровотока в тканевом микрорайоне пораженной вены [1]. Однако остается открытым вопрос, будет ли эффективным введение АССККП не в тромбированую вену, ток крови по которой нарушен, а в ткани рядом с такой веной. Не исключено, что паравазальная инъекция АССККП окажется более действенной в плане формирования новых сосудов и восстановления тока крови не в тромбированной вене, а именно в ее тканевом регионе. В связи с изложенным целью настоящего исследования было изучение возможности паравазального применения АССККП для восстановления кровотока в тромбированной вене в эксперименте. Материал и методы. Исследование проведено на самцах крыс линии Wag массой 180-200 г в возрасте 6 мес (n=214) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом. Получение АССККП, культивирование и трансфицирование ДНК плазмиды, содержащей ген GFP, были описаны ранее [1, 2, 8]. Кроме того, часть АССККП с геном GFP инкубировали согласно инструкции производителя (Sigma, США) с красителем ядер клеток DAPI в концентрации 1 мг/мл среды а-МЕМ с 10% эмбриональной сывороткой теленка, антибиотиком/антимикотиком (Gibco, США) в СО2инкубаторе в атмосфере насыщенной влажности. Через 10 мин среду сливали, клетки промывали физиологическим раствором на основе фосфатно-солевого буфера Дальбекко (БиолоТ, Россия) и заливали культуральной средой. Для моделирования венозного тромбоза использовали метод S. Wessler и соавт. [18], который применяется в настоящее время и подробно описан нами ранее [1]. Через 1 сут осуществляли повторный доступ к тромбированной вене и после удаления лигатуры в ткани справа и слева (не далее 5 мм) от тромбированной вены вводили по 50 мкл суспензии АССККП в культуральной среде (1×106 клеток в 1 мл). Животных умерщвляли передозировкой эфирного наркоза через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после введения АССККП. В качестве контроля использовали интактных крыс (n=12), животных с венозным тромбозом без использования АССККП (n=71) и с паравазальным применением АССККП без предварительного моделирования венозного тромбоза (n=72). Половине животных последней группы через 4 сут и 2 нед вводили АССККП с геном GFP и меткой ядер DAPI. Бедренную вену с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали под световым микроскопом Axioimager M1 (Zeiss, Германия) при увеличении до 1500 раз в режиме люминесценции с фильтрами Alexa 488 или DAPI. Результаты исследования. При исследовании методом люминесцентной микроскопии у интактных животных и при тромбозе без последующего введения АССККП во все сроки наблюдения в стенке магистральных сосудов и в паравазальной ткани (рис. 1, а), а также в тканях вдали от сосудистого пучка и в сосудах, проходящих в мышце бедра, специфическое свечение отсутствовало. Через 4 сут у контрольных животных, которым были введены АССККП, не только меченные GFP, но и с меткой клеточных ядер DAPI обнаружено, что в паравазальной ткани присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. В некоторых случаях эти клетки были выстроены в короткие цепочки. В грануляционной ткани встречались небольшие группы мелких сосудов, стенки которых полностью состояли из светящихся клеток (рис. 2, а-в). Использование двойной метки введенных АССККП позволило доказать их участие в ангиогенезе: при использовании фильтра «Alexa 488» в клетках ярким зеленым цветом светилась цитоплазма и оставалось темным ядро, при применении фильтра «DAPI» ядро светилось синим цветом, что было хорошо видно после совмещения результатов исследования с разными фильтрами для ультрафиолетового света (см. рис. 2, а-в). Через 4 сут после тромбирования вены и введения АССККП в ткани вокруг сосуда непосредственно в самой вене сохранялись только остатки тромба, бóльшая часть просвета такого сосуда была свободна. Фрагменты тромба на значительном протяжении располагались у стенки сосуда (пристеночный тромбоз) и были фрагментированы на более мелкие остатки и содержали крупные клетки, скорее всего, макрофаги. В тканях вокруг сосуда, в грануляциях на месте хирургического вмешательства было обнаружено множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме, а иногда - группы мелких сосудов капиллярного типа, в стенке которых также присутствовали светящиеся клетки. В некоторых случаях можно было видеть специфическое свечение в цитоплазме клеток и более темное ядро (см. рис. 1, б). Через 1 нед после инъекции АССККП рядом с нормальной веной в паравазальной ткани и остатках послеоперационных грануляций присутствовали единичные сосуды со специфически светящимися клетками в их стенках. В некоторых случаях были обнаружены группы мелких сосудов капиллярного типа со светящимися стенками и в них отдельные светящиеся клетки с более темным ядром (см. рис. 1, в). После тромбирования вены и введения АССККП в ткани вокруг сосуда тромб почти полностью лизирован и от него остались только мелкие пристеночные фрагменты. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке тромбированной вены не обнаружено (см. рис. 1, г). В тканях на месте операции были отмечены мелкие сосуды, стенка которых содержала светящиеся клетки. Такие сосуды были крупнее, и их стенка была толще, чем в предыдущий срок (рис. 1, д). В некоторых случаях можно было видеть клетки с ярким специфическим свечением в цитоплазме и с темным ядром (см. рис. 1, д). Через 2 нед у животных после введения АССККП и мечения GFP и ядерным красителем DAPI возле интактной вены в большинстве наблюдений в паравазальной ткани и в послеоперационном рубце присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. Также были обнаружены небольшие группы мелких сосудов, в стенке которых имелись светящиеся клетки. При использовании фильтра «Alexa 488» в них ярко светилась зеленым цветом цитоплазма и оставалось темным ядро, а при применении фильтра DAPI - отмечено специфическое синее свечение ядра (см. рис. 2, г-е). Через 2 нед после введения АССККП рядом с тромбированной веной проходимость всех сосудов была практически восстановлена. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке тромбированной вены не обнаружено. Количество сосудов со светящимися клетками в ткани около сосудистого пучка уменьшилось, практически исчезли структуры, похожие на грануляции. Очень редко были обнаружены группы сосудов, в стенках которых имелись клетки, со специфическим свечением в цитоплазме (см. рис. 1, е). В этот срок появилось специфическое свечение стенок отдельных сосудов венозного типа в мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет, в некоторых случаях в нем находились остатки тромба с макрофагами. Иногда такие сосуды с тромбом имели вид, характерный для процесса реканализации. Стенка сосуда была утолщена, в ней находились крупные клетки с темным ядром и светящейся цитоплазмой (см. рис. 1, ж). Просвет сосуда заполнен гетерогенными массами с большими отверстиями и перетяжками между ними, скорее всего, остатками частично лизированного тромба (см. рис. 1, ж). Через 3, 4 и 5 нед после введения АССККП около нормального сосуда как в стенке вены, так и в паравазальной ткани, а также в месте хирургического вмешательства не обнаружено специфически светящихся объектов. После операции по моделированию венозного тромбоза и введения АССККП рядом с тромбированной веной, как и в более ранние сроки, ни у одного животного светящихся объектов в стенке этой вены не обнаружено, так же как и фрагментов тромба в ее просвете. Основное место как в паравазальной, так и в рубцовой ткани на месте хирургического вмешательства и в грануляциях занимали сосуды без специфического свечения в своих структурах. Значительно реже и только в срок 3 нед имелись группы сосудов со специфическим свечением в стенке, но они были небольшими (см. рис. 1, з). В стенке таких сосудов можно было видеть клетки с ярко светящейся цитоплазмой и ядром (см. рис. 1, з). Обсуждение полученных данных. Несмотря на многочисленные данные литературы о положительных результатах применения клеточных технологий при лечении сосудистых тромбозов [6, 7, 9, 11, 12, 17], согласно нашим предыдущим [1] и настоящим результатам, восстановление кровотока в тромбированной магистральной вене в эксперименте на крысах всегда идет за счет тромболизиса, приводящего уже к 4-м суткам к рассасыванию значительной - большей части тромба в магистральной вене. Встраивания АССККП в стенку тромбированного сосуда не обнаружено ни в одном случае во все сроки эксперимента, как и признаков реканализации тромба и формирования коллатералей. При паравазальном введении АССККП без предварительного тромбирования вены в месте хирургического вмешательства было отмечено появление групп мелких сосудов, в стенке которых имелись клетки с ярко светящейся зеленым цветом цитоплазмой при использовании фильтра «Alexa 488» и светящимся синим цветом ядом при применении фильтра DAPI, т. е. уже к 4-м суткам в грануляциях, развивающихся на месте хирургической травмы, содержались сосуды, сформированные из введенных АССККП. Рост сосудов происходит как в результате прорастания уже имеющихся в регионе сосудов, так и за счет неоангиогенеза с привлечением клетокпредшественников из костного мозга [4, 15, 16]. При введении АССККП они сразу начинают встраиваться в растущие сосуды и формировать новые в результате дифференцировки в эндотелио-и перициты [2, 8]. Следует отметить, что при внутривенном введении АССККП было показано преимущественное формирование из них сосудов в тканях региона тромбированной вены [1]. Начиная с 1 нед после инъекции АССККП рядом с нормальной веной, количество светящихся клеток и сосудов, построенных из них, в месте хирургического вмешательства постепенно уменьшается, ас 3-й недели светящихся объектов практически нет. Наиболее вероятно, что это связано с заживлением раны и инволюцией грануляций. После введения АССККП на фоне сосудистого тромбоза в исследованные сроки в послеоперационных грануляциях присутствовало множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме или группы мелких сосудов капиллярного типа, стенки которых состояли из клеток со светящейся цитоплазмой и более темным ядром. Количество таких сосудов постепенно нарастало, и их стенки становились толще. Доказательством того, что указанные группы сосудов были сформированы именно в результате введения АССККП и из них, является свечение цитоплазмы клеток. Ген GFP, введенный в ДНК АССККП, неизменным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений. Эти клетки и структуры, сформированные из них, точно также светятся в отраженном ультрафиолетовом свете. Таким образом экономится время на миграцию собственных плюрипотентных клеток к месту операции и ускоряются процессы развития грануляций. С 2 нед от начала эксперимента количество сосудов со светящимися клетками в ткани возле сосудистого пучка начинает уменьшаться, постепенно исчезают структуры, похожие на грануляции. В основном там присутствуют сосуды без светящихся клеток в их стенке, и только в отдельных случаях в сосудистой стенке были обнаружены клетки со свечением. В ранние сроки эксперимента не было отмечено, но через 2 нед появилось специфическое свечение стенки сосудов венозного типа, расположенных в мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет. Иногда в мышечной ткани бедра были найдены сосуды с широким просветом, в котором находились остатки тромба с макрофагами. Патогенез тромбирования мелких сосудов, проходящих в мышечной ткани бедра, после введения тромбина, а также возможный механизм участия введенных АССККП в разрешении тромбоза были рассмотрены ранее [2] и останавливаться на этом еще раз не будем. Следует особо отметить, что при внутривенном введении АССККП было показано преимущественное формирование из них сосудов в тканях региона пораженной вены уже к 4-м суткам после применения клеточных технологий [1], т. е. в этом случае ангиогенез в ранние сроки преимущественно усиливается в мышцах бедра, а при паравазальном введении АССККП - в области хирургической травмы. Не исключено, что быстрое развитие грануляций в месте хирургического вмешательства после инъекции АССККП рядом с тромбированным сосудом может способствовать более быстрому очищению раны от детрита, нежизнеспособных тканей и антигенных веществ, раннему развитию репарационных процессов и быстрому ее заживлению. К 3-й неделе завершается репарация тканей, и полностью формируется рубец на месте операции. Численность сосудов, в стенке которых имеются светящиеся объекты, начинает сокращаться. Также уменьшается интенсивность свечения клеток в сосудистой стенке. Постепенное исчезновение свечения в стенке сосудов не всегда означает, что появились новые сосуды, построенные с участием собственных стволовых клеток, а сосуды, сформированные с привлечением введенных АССККП, исчезли. По-видимому, сначала сосуды в паравазальной ткани и грануляциях образуются с участием привнесенных извне АССККП. Постепенно, с исчезновением грануляций, на таких участках исчезают и сосуды, сформированные из клеток с белком GFP.

Об авторах

Игорь Валентинович Майбородин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: imai@mail.ru
Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Виталий Валерьевич Морозов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Яна Владимировна Новикова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Вера Александровна Матвеева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Людмила Владимировна Артемьева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Андрей Леонидович Матвеев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Роман Владимирович Маслов

Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова

кафедра пародонтологии стоматологического факультета 127473, Москва, ул. Делегатская, 20, стр

Наталья Валентиновна Оноприенко

Новосибирский государственный медицинский университет

кафедра акушерства и гинекологии 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52

Геннадий Анатольевич Частикин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Центр новых медицинских технологий 630090, г. Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 8

Список литературы

Дополнительные файлы