ANGIOGENESIS IN THE TISSUES AFTER THE INJECTION OF STROMAL STEM CELLS OF BONE MARROW ORIGIN CLOSE TO THROMBOSED VEIN IN AN EXPERIMENT

Full Text

В настоящее время наблюдается увеличе-тромба, быстрая реканализация вены и восстание числа больных с сосудистыми тромбозами новление кровообращения в ишемизированных [3], при этом успех репаративных процессов во в результате тромбоза тканях были достигнуты многом определяется развитием коллатерально-в экспериментальных моделях с проангиогенными го кровотока и реканализацией самого тромба. агентами [5, 7, 10, 13, 14, 17]. Анализ причин неудачного лечения таких больных Методами люминесцентной микроскопии изусвидетельствует о том, что для их преодоления чали результаты введения аутологичных мультинеобходимо как усовершенствование технологии потентных стромальных (мезенхимальных) ствомедикаментозного и хирургического лечения, так ловых клеток костномозгового происхождения и создание оптимальных условий для восстановле-(АССККП) с геном зеленого флюоресцентного ния кровотока. белка (GFP) в тромбированную вену задней конеч Красный костный мозг содержит прогени-ности крыс. Было обнаружено, что восстановлеторные клетки, способные к дифференциров-ние кровотока в тромбированной магистральной ке в эндотелиоциты и перициты. Это позволяет вене всегда идет за счет тромболизиса. Признаков широко применять такие клетки для ускорения встраивания введенных АССККП в стенку тромреваскуляризации тканей с нарушенной микро-бированного сосуда, реканализации тромба и форциркуляцией [6, 7, 9, 11, 12, 17]. Реваскуляризация мирования коллатералей обнаружено не было [1]. При моделировании тромбоза в эксперименте введением тромбина и лигированием магистральной вены также происходит тромбирование ее мелких ветвей, где восстановление кровотока происходит или путем реканализации тромба или прорастания новых. АССККП участвуют в обоих этих процессах, что приводит к более быстрому восстановлению кровотока в тканевом микрорайоне пораженной вены [1]. Однако остается открытым вопрос, будет ли эффективным введение АССККП не в тромбированую вену, ток крови по которой нарушен, а в ткани рядом с такой веной. Не исключено, что паравазальная инъекция АССККП окажется более действенной в плане формирования новых сосудов и восстановления тока крови не в тромбированной вене, а именно в ее тканевом регионе. В связи с изложенным целью настоящего исследования было изучение возможности паравазального применения АССККП для восстановления кровотока в тромбированной вене в эксперименте. Материал и методы. Исследование проведено на самцах крыс линии Wag массой 180-200 г в возрасте 6 мес (n=214) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», все манипуляции осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом. Получение АССККП, культивирование и трансфицирование ДНК плазмиды, содержащей ген GFP, были описаны ранее [1, 2, 8]. Кроме того, часть АССККП с геном GFP инкубировали согласно инструкции производителя (Sigma, США) с красителем ядер клеток DAPI в концентрации 1 мг/мл среды а-МЕМ с 10% эмбриональной сывороткой теленка, антибиотиком/антимикотиком (Gibco, США) в СО2инкубаторе в атмосфере насыщенной влажности. Через 10 мин среду сливали, клетки промывали физиологическим раствором на основе фосфатно-солевого буфера Дальбекко (БиолоТ, Россия) и заливали культуральной средой. Для моделирования венозного тромбоза использовали метод S. Wessler и соавт. [18], который применяется в настоящее время и подробно описан нами ранее [1]. Через 1 сут осуществляли повторный доступ к тромбированной вене и после удаления лигатуры в ткани справа и слева (не далее 5 мм) от тромбированной вены вводили по 50 мкл суспензии АССККП в культуральной среде (1×106 клеток в 1 мл). Животных умерщвляли передозировкой эфирного наркоза через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после введения АССККП. В качестве контроля использовали интактных крыс (n=12), животных с венозным тромбозом без использования АССККП (n=71) и с паравазальным применением АССККП без предварительного моделирования венозного тромбоза (n=72). Половине животных последней группы через 4 сут и 2 нед вводили АССККП с геном GFP и меткой ядер DAPI. Бедренную вену с окружающими тканями фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Неокрашенные срезы толщиной 5-7 мкм изучали под световым микроскопом Axioimager M1 (Zeiss, Германия) при увеличении до 1500 раз в режиме люминесценции с фильтрами Alexa 488 или DAPI. Результаты исследования. При исследовании методом люминесцентной микроскопии у интактных животных и при тромбозе без последующего введения АССККП во все сроки наблюдения в стенке магистральных сосудов и в паравазальной ткани (рис. 1, а), а также в тканях вдали от сосудистого пучка и в сосудах, проходящих в мышце бедра, специфическое свечение отсутствовало. Через 4 сут у контрольных животных, которым были введены АССККП, не только меченные GFP, но и с меткой клеточных ядер DAPI обнаружено, что в паравазальной ткани присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. В некоторых случаях эти клетки были выстроены в короткие цепочки. В грануляционной ткани встречались небольшие группы мелких сосудов, стенки которых полностью состояли из светящихся клеток (рис. 2, а-в). Использование двойной метки введенных АССККП позволило доказать их участие в ангиогенезе: при использовании фильтра «Alexa 488» в клетках ярким зеленым цветом светилась цитоплазма и оставалось темным ядро, при применении фильтра «DAPI» ядро светилось синим цветом, что было хорошо видно после совмещения результатов исследования с разными фильтрами для ультрафиолетового света (см. рис. 2, а-в). Через 4 сут после тромбирования вены и введения АССККП в ткани вокруг сосуда непосредственно в самой вене сохранялись только остатки тромба, бóльшая часть просвета такого сосуда была свободна. Фрагменты тромба на значительном протяжении располагались у стенки сосуда (пристеночный тромбоз) и были фрагментированы на более мелкие остатки и содержали крупные клетки, скорее всего, макрофаги. В тканях вокруг сосуда, в грануляциях на месте хирургического вмешательства было обнаружено множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме, а иногда - группы мелких сосудов капиллярного типа, в стенке которых также присутствовали светящиеся клетки. В некоторых случаях можно было видеть специфическое свечение в цитоплазме клеток и более темное ядро (см. рис. 1, б). Через 1 нед после инъекции АССККП рядом с нормальной веной в паравазальной ткани и остатках послеоперационных грануляций присутствовали единичные сосуды со специфически светящимися клетками в их стенках. В некоторых случаях были обнаружены группы мелких сосудов капиллярного типа со светящимися стенками и в них отдельные светящиеся клетки с более темным ядром (см. рис. 1, в). После тромбирования вены и введения АССККП в ткани вокруг сосуда тромб почти полностью лизирован и от него остались только мелкие пристеночные фрагменты. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке тромбированной вены не обнаружено (см. рис. 1, г). В тканях на месте операции были отмечены мелкие сосуды, стенка которых содержала светящиеся клетки. Такие сосуды были крупнее, и их стенка была толще, чем в предыдущий срок (рис. 1, д). В некоторых случаях можно было видеть клетки с ярким специфическим свечением в цитоплазме и с темным ядром (см. рис. 1, д). Через 2 нед у животных после введения АССККП и мечения GFP и ядерным красителем DAPI возле интактной вены в большинстве наблюдений в паравазальной ткани и в послеоперационном рубце присутствовали единичные специфически светящиеся клетки. Также были обнаружены небольшие группы мелких сосудов, в стенке которых имелись светящиеся клетки. При использовании фильтра «Alexa 488» в них ярко светилась зеленым цветом цитоплазма и оставалось темным ядро, а при применении фильтра DAPI - отмечено специфическое синее свечение ядра (см. рис. 2, г-е). Через 2 нед после введения АССККП рядом с тромбированной веной проходимость всех сосудов была практически восстановлена. Ни у одного животного светящихся объектов в стенке тромбированной вены не обнаружено. Количество сосудов со светящимися клетками в ткани около сосудистого пучка уменьшилось, практически исчезли структуры, похожие на грануляции. Очень редко были обнаружены группы сосудов, в стенках которых имелись клетки, со специфическим свечением в цитоплазме (см. рис. 1, е). В этот срок появилось специфическое свечение стенок отдельных сосудов венозного типа в мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет, в некоторых случаях в нем находились остатки тромба с макрофагами. Иногда такие сосуды с тромбом имели вид, характерный для процесса реканализации. Стенка сосуда была утолщена, в ней находились крупные клетки с темным ядром и светящейся цитоплазмой (см. рис. 1, ж). Просвет сосуда заполнен гетерогенными массами с большими отверстиями и перетяжками между ними, скорее всего, остатками частично лизированного тромба (см. рис. 1, ж). Через 3, 4 и 5 нед после введения АССККП около нормального сосуда как в стенке вены, так и в паравазальной ткани, а также в месте хирургического вмешательства не обнаружено специфически светящихся объектов. После операции по моделированию венозного тромбоза и введения АССККП рядом с тромбированной веной, как и в более ранние сроки, ни у одного животного светящихся объектов в стенке этой вены не обнаружено, так же как и фрагментов тромба в ее просвете. Основное место как в паравазальной, так и в рубцовой ткани на месте хирургического вмешательства и в грануляциях занимали сосуды без специфического свечения в своих структурах. Значительно реже и только в срок 3 нед имелись группы сосудов со специфическим свечением в стенке, но они были небольшими (см. рис. 1, з). В стенке таких сосудов можно было видеть клетки с ярко светящейся цитоплазмой и ядром (см. рис. 1, з). Обсуждение полученных данных. Несмотря на многочисленные данные литературы о положительных результатах применения клеточных технологий при лечении сосудистых тромбозов [6, 7, 9, 11, 12, 17], согласно нашим предыдущим [1] и настоящим результатам, восстановление кровотока в тромбированной магистральной вене в эксперименте на крысах всегда идет за счет тромболизиса, приводящего уже к 4-м суткам к рассасыванию значительной - большей части тромба в магистральной вене. Встраивания АССККП в стенку тромбированного сосуда не обнаружено ни в одном случае во все сроки эксперимента, как и признаков реканализации тромба и формирования коллатералей. При паравазальном введении АССККП без предварительного тромбирования вены в месте хирургического вмешательства было отмечено появление групп мелких сосудов, в стенке которых имелись клетки с ярко светящейся зеленым цветом цитоплазмой при использовании фильтра «Alexa 488» и светящимся синим цветом ядом при применении фильтра DAPI, т. е. уже к 4-м суткам в грануляциях, развивающихся на месте хирургической травмы, содержались сосуды, сформированные из введенных АССККП. Рост сосудов происходит как в результате прорастания уже имеющихся в регионе сосудов, так и за счет неоангиогенеза с привлечением клетокпредшественников из костного мозга [4, 15, 16]. При введении АССККП они сразу начинают встраиваться в растущие сосуды и формировать новые в результате дифференцировки в эндотелио-и перициты [2, 8]. Следует отметить, что при внутривенном введении АССККП было показано преимущественное формирование из них сосудов в тканях региона тромбированной вены [1]. Начиная с 1 нед после инъекции АССККП рядом с нормальной веной, количество светящихся клеток и сосудов, построенных из них, в месте хирургического вмешательства постепенно уменьшается, ас 3-й недели светящихся объектов практически нет. Наиболее вероятно, что это связано с заживлением раны и инволюцией грануляций. После введения АССККП на фоне сосудистого тромбоза в исследованные сроки в послеоперационных грануляциях присутствовало множество отдельно расположенных клеток со специфическим свечением в цитоплазме или группы мелких сосудов капиллярного типа, стенки которых состояли из клеток со светящейся цитоплазмой и более темным ядром. Количество таких сосудов постепенно нарастало, и их стенки становились толще. Доказательством того, что указанные группы сосудов были сформированы именно в результате введения АССККП и из них, является свечение цитоплазмы клеток. Ген GFP, введенный в ДНК АССККП, неизменным передается дочерним клеткам и клеткам следующих поколений. Эти клетки и структуры, сформированные из них, точно также светятся в отраженном ультрафиолетовом свете. Таким образом экономится время на миграцию собственных плюрипотентных клеток к месту операции и ускоряются процессы развития грануляций. С 2 нед от начала эксперимента количество сосудов со светящимися клетками в ткани возле сосудистого пучка начинает уменьшаться, постепенно исчезают структуры, похожие на грануляции. В основном там присутствуют сосуды без светящихся клеток в их стенке, и только в отдельных случаях в сосудистой стенке были обнаружены клетки со свечением. В ранние сроки эксперимента не было отмечено, но через 2 нед появилось специфическое свечение стенки сосудов венозного типа, расположенных в мышечной ткани бедра. Практически всегда сосуды со специфическим свечением имели широкий просвет. Иногда в мышечной ткани бедра были найдены сосуды с широким просветом, в котором находились остатки тромба с макрофагами. Патогенез тромбирования мелких сосудов, проходящих в мышечной ткани бедра, после введения тромбина, а также возможный механизм участия введенных АССККП в разрешении тромбоза были рассмотрены ранее [2] и останавливаться на этом еще раз не будем. Следует особо отметить, что при внутривенном введении АССККП было показано преимущественное формирование из них сосудов в тканях региона пораженной вены уже к 4-м суткам после применения клеточных технологий [1], т. е. в этом случае ангиогенез в ранние сроки преимущественно усиливается в мышцах бедра, а при паравазальном введении АССККП - в области хирургической травмы. Не исключено, что быстрое развитие грануляций в месте хирургического вмешательства после инъекции АССККП рядом с тромбированным сосудом может способствовать более быстрому очищению раны от детрита, нежизнеспособных тканей и антигенных веществ, раннему развитию репарационных процессов и быстрому ее заживлению. К 3-й неделе завершается репарация тканей, и полностью формируется рубец на месте операции. Численность сосудов, в стенке которых имеются светящиеся объекты, начинает сокращаться. Также уменьшается интенсивность свечения клеток в сосудистой стенке. Постепенное исчезновение свечения в стенке сосудов не всегда означает, что появились новые сосуды, построенные с участием собственных стволовых клеток, а сосуды, сформированные с привлечением введенных АССККП, исчезли. По-видимому, сначала сосуды в паравазальной ткани и грануляциях образуются с участием привнесенных извне АССККП. Постепенно, с исчезновением грануляций, на таких участках исчезают и сосуды, сформированные из клеток с белком GFP.

About the authors

I. V. Maiborodin

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Email: imai@mail.ru
Center of New Medical Technologies

V. V. Morozov

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

Ya. V. Novikova

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

V. A. Matveyeva

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

L. V. Artemiyeva

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

A. L. Matveyev

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

R. V. Maslov

A. I. Yevdokimov Moscow Sate Medico-Stomatologic University

Department of Parodontology, Stomatologic Faculty

N. V. Onopriyenko

Novosibirsk State Medical University

Department of Obstetrics and Gynecology

G. A. Chastikin

RAS Siberian Branch Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine

Center of New Medical Technologies

References

Supplementary files