ИЗМЕНЕНИЯ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО АППАРАТА И СОСУДОВ ЯИЧНИКОВ У КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ МЕЛАТОНИНА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРТЕРМИИ

Полный текст

Известно, что различные экстремальные воздействия приводят к нарушениям систем адаптации и детоксикации, а также десинхронизации биоритмов организма. В восстановлении нарушенного гомеостаза и оптимизации функций различных органов и систем принимает участие гормон шишковидной железы мелатонин (МТ). МТ также участвует в регуляции секреции половых гормонов, обеспечивая, тем самым, созревание и функционирование репродуктивной системы [1, 2, 4, 5]. В современных условиях возрастает негативное влияние на организм человека высоких температур окружающей среды. Установлено, что перегревание вызывает глубокие нарушения деятельности организма, в частности, органов репродуктивной системы [7-9, 14]. Влияние МТ на структурную организацию яичников в условиях гипертермии изучено недостаточно. Цель настоящего исследования - оценка морфологических изменений фолликулярного аппарата и сосудов яичников у крыс под влиянием МТ в разные сроки после воздействия экспериментальной гипертермии (ЭГ). Материал и методы. В эксперименте использовали 155 крыс-самок линии Вистар (возраст 3 мес, масса 180-200 г). Животных содержали при температуре воздуха 20-22 °C на стандартном пищевом рационе при свободном доступе к воде. Экспериментальные воздействия выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Животных, находящихся в фазе диэструса полового цикла, подвергали ЭГ в соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [6]. Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя подбирался экспериментально и составил 45 °C. Время разогревания каждой особи до ректальной температуры 43,5 °C было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы животного и составляло не более 17 мин. Уровень ЭГ, при котором прекращали разогревание, определялся ректальной температурой 43,5 °C (стадия теплового удара). Гибели крыс от гипертермии не было. В качестве исходного брали препарат МТ ICN Biomedical Inc. (США). МТ вводили в день проведения ЭГ и в последующие 2 сут после захода солнца (по 0,1 мг МТ в 0,2 мл физиологического раствора-«Плацебо»). Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом на 3-, 7-е и 14-е сутки после однократного воздействия ЭГ. Выделено 7 групп животных: 1-я - контрольная (интактные животные) - n=23, 2-я группа - на 3-и сутки после ЭГ (ЭГ+3 сут), 3-я - на 7-е сутки после ЭГ (ЭГ+7 сут), 4-я - на 14-е сутки после ЭГ (ЭГ+14 сут), 5-я - на 3-и сутки после ЭГ и введения МТ (ЭГ+МТ+3 сут), 6-я - на 7-е сутки после ЭГ и введения МТ (ЭГ+МТ+7 сут), 7-я - на 14-е сутки после ЭГ и введения МТ (ЭГ+МТ+14 сут). Животным 2-, 3-йи 4-й групп после ЭГ вводили подкожно по 0,2 мл физиологического раствора. В каждую экспериментальную группу входили по 22 животных. Яичники брали после декапитации животных под эфирным наркозом. Для светооптического исследования яичники фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заключали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 5-6 мкм и после депарафинизирования окрашивали их гематоксилином Майера - эозином. Методом точечного счета вычисляли относительную суммарную площадь сосудов коркового и мозгового вещества яичников, а также примордиальных, первичных, вторичных, предовуляторных и атретических фолликулов. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007 на PC Pentium 4 в среде Windows с использованием статистического пакета «Statistiсa 5.5», с вычислением средних величин и их стандартных ошибок. Различия между показателями в контрольной и подопытных группах оценивали по критерию Стьюдента и считали значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Введение МТ животным в условиях перегревания приводит к развитию в яичниках морфологических изменений меньшей тяжести, чем в группе животных без коррекции. На 3-и сутки после ЭГ в яичниках животных (группа ЭГ+3 сут) и по сравнению с интактными наблюдается резко выраженный венозный застой, отечность интерстициальных несосудистых путей микроциркуляции, расширение лимфатических сосудов. Хотя в яичниках животных, получавших МТ (группа ЭГ+МТ+3 сут), наблюдаются признаки венозного застоя, отечности интерстициальных несосудистых путей микроциркуляции, однако эти изменения менее выражены, чем в группе крыс без введения МТ (группа ЭГ+3 сут). Это подтвердили и данные морфометрического анализа, показавшие, что относительная площадь вен в группе ЭГ+3 сут в 2,5 раза, а лимфатических сосудов - в 4,6 раза превышает контрольные значения. В яичниках животных, получавших МТ (группа ЭГ+МТ+3 сут), выявлено существенное уменьшение значений аналогичных показателей по сравнению с таковыми в группе без введения МТ и меньшее их возрастание, чем в контрольной группе (относительная площадь вен увеличивается в 1,3 раза, а лимфатических сосудов - в 1,6 раза) (таблица). Полученные данные свидетельствуют об улучшении кровообращения и лимфатического дренажа в органе при введении МТ уже в острый период после воздействия. Оценка относительной площади фолликулярного аппарата яичников показала, что в острый период после воздействия ЭГ (3-и сутки) эффекта введения МТ практически не наблюдается (см. таблицу). На 7-е сутки после ЭГ в группе без введения МТ - ЭГ+7 сут восстановления морфологической организации сосудистых компартментов яичников не происходит (рисунок, а); количественный анализ показал, что относительная площадь артерий в 2 раза ниже, чем в контроле, а относительная площадь лимфатических сосудов в 2 раза превышает контрольные значения. В группе животных, получавших МТ, на 7-е сутки после воздействия происходит полное восстановление кровообращения и лимфотока в яичниках, сопровождающееся уменьшением отечности тканей яичника (см. рисунок, б). Это подтверждают и данные морфометрического анализа, показавшие изменение относительной площади артерий, вен и лимфатических сосудов яичников в этой группе до уровня контроля (см. таблицу), что создает условия для быстрого восстановления генеративных элементов органа. Количественная оценка фолликулярного аппарата яичников выявила, что на 7-е сутки после воздействия относительная площадь первичных фолликулов в группе без коррекции (ЭГ+7 сут) снижается в 17 раз по сравнению с контролем. В то же время, в группе с введением МТ (ЭГ+МТ+7 сут) происходит менее выраженное снижение этого показателя в 3 раза по сравнению с контролем. Относительная площадь предовуляторных фолликулов в группе ЭГ+7 сут снижается до 40% от исходного уровня, в то время как относительная площадь предовуляторных фолликулов в группе ЭГ+МТ+7 сут в 1,6 раза выше, чем в контроле - у интактных животных. Отчетливо выраженный эффект наблюдается также и в отношении атретических фолликулов, относительная площадь которых в группе ЭГ+МТ+7 сут в 10 раз превышает контрольные значения, в то время как в группе ЭГ+7 сут - в 25 раз (см. таблицу). Относительная площадь примордиальных фолликулов в группе ЭГ+7 сут снижена в 2,5 раза по сравнению с контролем и сохраняется на том же уровне и в группе с коррекцией МТ (см. таблицу). На 14-е сутки после ЭГ в яичниках местами сохраняется расширение интерстициальных несосудистых путей микроциркуляции и лимфатических сосудов, наблюдается гемостаз (см. рисунок, в). В группе с введением МТ (ЭГ+МТ+14 сут) морфологическая организация сосудистых компартментов яичников соответствует норме (см. рисунок, г). При количественной оценке фолликулярного аппарата яичников на 14-е сутки после воздействия ЭГ выявлено, что относительная площадь предовуляторных фолликулов на треть превышает контрольный уровень. В группе ЭГ+МТ+14 сут относительная площадь этих фолликулов незначительно снижена по сравнению с контролем (см. таблицу). Обсуждение полученных данных. В настоящее время установлено, что тепловой стресс (включая воздействия высокой температуры как климатического фактора) приводит к развитию бесплодия посредством различных механизмов, в том числе, изменяя гормональную секрецию, он участвует в повреждении яйцеклеток [7, 13]. При воздействии повышенной температуры (41 °C) в фолликулярных клетках яичников у коров выявлено снижение продукции эстрадиола и увеличение секреции прогестерона, что приводит к их преждевременной дифференциации и лютеинизации [9]. Большинство исследователей считают главным механизмом гибели клеток при воздействии температуры выше 40 °C денатурацию белка, которая вызывает изменения структуры молекул цитоскелета и мембран клеток, повреждение ферментов, участвующих в синтезе и репарации ДНК, что индуцирует в яичниках процессы программируемой клеточной гибели фолликулярных клеток и овоцитов [7, 13, 14]. Наиболее многочисленные исследования посвящены применению гипертермии в онкологической практике. Доказано, что воздействие ЭГ повышает чувствительность злокачественных клеток к лучевой и химиотерапии [8]. Основными механизмами этого процесса считаются дезинтеграция клеточных мембран и развитие сосудистых повреждений в опухоли, включая ингибицию кровотока. Также одним из механизмов негативных эффектов воздействия высокой температуры на морфологическую организацию яичников являются нарушения кровообращения [14] и, согласно данным нашего исследования, лимфотока в органе, приводящие к расширению интерстициальных пространств и появлению отека и, как следствие, формированию лимфостаза в зоне лимфосбора в яичниках. Такие морфологические перестройки способствуют развитию тканевой гипоксии и нарушению гуморальной регуляции, которые приводят к значительным изменениям фолликулогенеза, вызывают усиление процессов дегенерации и атрезии фолликулов [13]. В нашем исследовании это проявлялось снижением относительной площади примордиальных, первичных и предовуляторных фолликулов, а также увеличением относительной площади атретических фолликулов. При этом наиболее значительные изменения наблюдались на 7-е сутки и сохранялись до 14-х суток после перегревания. Следует подчеркнуть, что обеспечение и поддержание гомеостаза развивающихся фолликулов прямо зависят от интенсивности микроциркуляции, поскольку при движении крови, интерстициальной жидкости и лимфы происходят перенос различных веществ и обмен информацией между структурными элементами яичника, а нарушение кровообращения и лимфотока способствует развитию гипоксии, нарушению проницаемости митохондриальных мембран и гибели клеток [3]. Известно, что экстремальное перегревание (до 42-43 °C) запускает в организме механизмы развития окислительного стресса с активацией процессов перекисного окисления липидов на фоне инактивации антиоксидантной защиты. При окислительно-восстановительном дисбалансе в клетках яичников развиваются патологические изменения, которые способствуют активации апоптоза клеток [8]. В настоящее время общепризнано, что МТ является основным синхронизатором биологических ритмов организма, универсальным эндогенным адаптогеном и иммуномодулятором [2, 5]. МТ расценивается как гормональный мессенджер, модулирующий активность репродуктивной и других систем в зависимости от фотопериодического окружения [4]. Наше исследование показало, что введение МТ приводит к менее выраженным нарушениям морфологической организации яичников в острый период после ЭГ и способствует развитию восстановительных изменений в яичниках на 7-еи 14-е сутки по сравнению с таковыми у животных, не получавших инъекций гормона. В группе животных с введением МТ выявлена более быстрая (уже на 7-е сутки после ЭГ) нормализация нарушений венозного русла и лимфатического дренажа яичников до уровня в контроле. Полученные нами данные согласуются с работами других исследователей, установивших регулирующее влияние МТ на сосудистый тонус за счет связывания с собственными рецепторами у гладких миоцитов и эндотелиоцитов кровеносных сосудов [5]. Известно, что первым звеном механизма регионарного клеточно-тканевого дренажа является перемещение тканевой воды в интерстициальных тканевых пространствах к корням лимфатической системы, завершающееся лимфообразованием [3]. Восстановление интерстициальной несосудистой микроциркуляции при введении МТ (на 7-е и 14-е сутки после перегревания) свидетельствует о разгрузке регионарного аппарата дренирования яичника, что способствует улучшению процессов лимфодетоксикации в органе [3]. При этом, введение МТ, нормализуя кровообращение и лимфоток в яичниках, создает условия для более быстрого восстановления генеративных элементов (первичных и предовуляторных фолликулов) уже на 7-е сутки после ЭГ, а также приводит к уменьшению процессов атрезии фолликулов. Можно предположить, что одним из механизмов этого процесса является участие МТ в регуляции программируемой клеточной гибели, поскольку рецепторы МТ (MT1 и MT2) были обнаружены в клетках яичника на плазмолемме, ядерных мембранах и в цитоплазме [11, 15]. Под контролирующим влиянием МТ также находятся процессы пролиферации клеток яичников и продукции ими гормонов. Показано, что экзогенный МТ стимулирует секрецию прогестерона и эстрадиола и приводит к подавлению апоптоза клеток, но не пролиферации [15]. Необходимо отметить, что нейрогормон МТ обладает способностью непосредственно нейтрализовывать свободные радикалы и родственные токсические вещества и их вредное воздействие на клетки и ткани, поэтому его введением обеспечивается дополнительная антиоксидантная защита организма [4] и репродуктивной функции женщин [5, 10]. Также установлено, что МТ предохраняет макромолекулы (белки, жиры, ядерную и митохондриальную ДНК) от оксидативного повреждения во всех субклеточных структурах [4, 10]. Антиоксидантная способность МТ обеспечивается его способностью детоксицировать свободные радикалы за счет образования «антиоксидантномелатонинового каскада». Выявлены регулирующее влияние МТ на процессы программируемой клеточной гибели и состояние Ca2+-каналов клеток, приводящее к ингибиции апоптоза клеток в условиях окислительного стресса [12, 15]. Таким образом, установлено корригирующее влияние МТ на морфологическую организацию кровеносных и лимфатических сосудов, фолликулярного аппарата яичников (уже на 7-е сутки после перегревания). Результаты исследования указывают на возможность использования МТ с целью коррекции нарушений генеративной функции, вызванных воздействием высокой температуры, а также могут являться основой для разработки патогенетической лимфотропной терапии заболеваний органов репродуктивной системы.

Об авторах

Алла Львовна Бочкарева

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии

Email: bochkarevaalla@bk.ru
группа гистолимфатических отношений, лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Светлана Викторовна Мичурина

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии

Email: s.michurina@ngs.ru
группа гистолимфатических отношений, лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Владимир Иосифович Коненков

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии

группа гистолимфатических отношений, лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Игорь Гельевич Бочкарев

Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии

группа гистолимфатических отношений, лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Список литературы

Дополнительные файлы