МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА ПРИ ОДНОКРАТНОМ И ПОВТОРНОМ КУРСАХ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ

Полный текст

Проблема лечения травм нервов остаётся актуальной, поскольку, несмотря на достижения микрохирургии и реабилитационной медицины, восстановление функции после аксотомии и нейротмезиса достигается только у 50% пациентов [14]. Аксотомированные нейроны претерпевают сложные структурные преобразования, и часть из них подвергаются апоптозу [12]. Регенераторный рост нервных волокон осложнён эндоневральным фиброзом, гибелью шванновских клеток, низким уровнем экспрессии нейротрофических факторов [16]. Корректное сопоставление пучков волокон пересечённого нерва во время микрохирургической операции не исключает врастания регенерирующих аксонов в другие эндоневральные трубки и реиннервации несоответствующих органовмишеней. Восстановление диаметров аксонов проприоцептивных и двигательных регенерирующих волокон, а также толщины их миелиновых оболочек длится многие месяцы и годы [13]. Перечисленные факторы предопределяют недостаточную скорость проведения импульсов по регенерировавшим нервам и необратимые изменения органов-мишеней. Для оптимизации процесса нейрорегенерации исследуются разнообразные способы фармакотерапии, обеспечивающие нейротрофические и нейропротективные эффекты [2, 6]. Другим развивающимся направлением реабилитационной терапии является лечебная электростимуляция (ЭС). Воздействие электрического тока может как ускорить, так и нарушить процесс регенерации, поэтому требует тщательных доклинических испытаний. Его результат определяется многочисленными условиями, в том числе параметрами электрического тока (силой, частотой, формой импульсов), расположением и способами подведения электродов, продолжительностью и количеством процедур. Известны положительные результаты ЭС при повреждениях периферических нервов и сплетений в клинике [3, 5]. Электрофизиологические исследования регистрировали более раннее появление признаков регенерации нерва, чем в нестимулированном контроле, но в отдалённые сроки регенерации наблюдали постепенное выравнивание основных электрофизиологических параметров в группах больных с ЭС и общепринятыми методиками реабилитационного лечения [3]. Структурные механизмы этого явления неизвестны, что даёт основание провести экспериментальные исследования соответствующего направления. Цель данной работы — уточнение представлений о динамике восстановления морфометрических параметров регенерации нерва в условиях ЭС и определение целесообразности проведения её повторного курса. Материал и методы . Исследование выполнено на 44 взрослых беспородных собаках. Из них — 3 интактных, а 41 — оперированы под внутривенным комбинированным наркозом в условиях операционной: правый седалищный нерв (СН) пересекали зубчатыми ножницами Millesi на уровне середины бедра и сшивали с применением микрохирургической техники: операционный микроскоп ГК 20 Opton (Opton, Германия), инструментарий фирмы «Aesculap» (Германия), шовный материал калибра 8/0 фирмы «Ethicon» (Великобритания). В контрольной группе животных (n=23) никаких терапевтических воздействий на регенераторный процесс не применяли. В подопытной группе (n=18) д-ром мед. наук И. А. Меньщиковой проведены курсы ЭС с помощью переносного двухканального электростимулятора ЭСИ-3 (Россия) по методике [1], адаптированной к условиям эксперимента. Каждая процедура продолжительностью 40 мин состояла из двух частей: 20 мин — ЭС сегментов спинного мозга, 20 мин — ЭС нерва проксимальнее повреждения. Между остистыми отростками позвонков LI–LIV поочередно вводили игольчатый электрод, который подключали к отрицательному полюсу аппарата, положительный пластинчатый электрод кольцеобразно накладывали на область голени. Для ЭС нерва игольчатый электрод вводили между большим вертелом бедренной кости и бугром седалищной кости, пластинчатый — также располагали в области голени. Процедуры проводили трижды в неделю. Режим тока переменный, форма импульсов прямоугольная, частота 50 Гц, длительность импульса — 0,7 мс, длительность посылки — 2 с; соотношение «посылка—пауза» — 2:2. Силу тока подбирали индивидуально, до видимого мышечного ответа, в диапазоне от 4 до 20 мА. Для временного торможения двигательной активности собак перед каждым сеансом их вводили в медикаментозный сон с помощью комбинации минимальных доз препаратов, традиционно используемых в ветеринарии. Курс из 18 сеансов ЭС начинали через 1 мес после операции и заканчивали через 2,5 мес. У 5 собак из 18 провели повторный курс в период от 6 до 7,5 мес после операции; они составили подгруппу ЭС2, остальные 12 — подгруппу ЭС1. При выполнении экспериментальных исследований руководствовались требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996 г.). Животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов. Для гистологического исследования иссекали СН в пределах оперированного бедра и его ветви (большеберцовый и поверхностный малоберцовый нервы) на голени. После альдегидно-осмиевой фиксации кусочки нервов заливали в эпоксидные смолы. Поперечные полутонкие (толщиной 1 мкм) срезы нервов дистальнее уровня швов и соответствующих участков интактных нервов получали на ультратоме Nova (LKB, Швеция) и окрашивали по Уикли [4]. Срезы исследовали с помощью микроскопа Opton III (Opton, Германия), оцифровку и анализ изображений — аппаратно-программного комплекса ДиаМорф (ЗАО ДиаМорф, Россия). С наиболее репрезентативного среза дистального отрезка СН оцифровывали от 30 до 80 полей зрения (увеличение 1250) и таким образом от каждой собаки получали изображения 300–500 миелиновых нервных волокон. Измеряли диаметры миелиновых волокон (ДМВ), аксонов (ДА), толщину миелиновой оболочки (ТМО), аксомиелиновое отношение (ДА/ДМВ). Рассчитывали средние размерные показатели, а также численную плотность миелиновых волокон. Определяли долю дегенерирующих миелиновых волокон и пустых эндоневральных трубок (ДгВ, %). Для двойного контроля результатов морфометрировали нервы 3 интактных собак. Строили частотные гистограммы распределения миелиновых волокон по диаметру (шаг 1 мкм) по данным от каждого животного и усреднённые гистограммы по каждой группе. В выборке каждого нерва и в каждой группе отмечали миелиновое волокно, имеющее максимальный диаметр. Для определения объёмной плотности нейральных элементов проводили точко-счётную объёмометрию, используя электронную версию оригинальной тестовой решетки [9], состоящей из 100 узлов с прозрачными центрами. Для статистической обработки данных использовали критерии Вилкоксона—Манна—Уитни, Пагуровой, Лемана – Розенблатта,значениякоторыхполучаливкомпьютернойпрограмме Attestat, версия 9.3.1 (разработчик И. П. Гайдышев, свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ в реестре Роспатента №2002611109, дата регистрации 28.06.2002 г.). Результаты исследования . Через 2,5 мес в оперированном седалищном и берцовых нервах у животных подопытной и контрольной групп обнаружено большое количество регенерирующих миелиновых и безмиелиновых волокон. Берцовые нервы содержат значительное количество нагруженных липидными вакуолями макрофагов в эндоневрии и расширенных субпериневральных пространствах, многие периневральные клетки тоже содержат многочисленные липидные вакуоли. Подопытная группа отличается от контроля меньшей выраженностью эндоневрального отёка и более выраженной эпиневральной гиперваскуляризацией в берцовых нервах. При количественном анализе установлено, что различия численной плотности нервных волокон не значимы. Доля ДгВ значительно больше в контроле, в опыте этот показатель сопоставим с нормой. Объёмная плотность нейральных элементов в дистальном отрезке СН у разных животных варьировала: в опыте — от 51 до 76%, в контроле — от 38 до 42% (p<0,5). ДА/ДМВ, ДМВ и максимальный диаметр регенерирующих миелиновых волокон значимо больше в опыте (таблица). ДА в опыте на 13,6% (рис. 1, а) больше, чем в контроле, но ТМО сопоставима с ним (см. рис. 1, б). Через 4 мес после операции отсутствуют — так же, как и в последующие сроки после операции — статистически значимые различия между опытом и контролем по параметрам объёмной и численной плотности нервных волокон. По сравнению с предыдущим сроком и в опыте, ив контроле средние размерные параметры миелиновых волокон увеличились: ДМВ — на 22,2 и 31,6% соответственно (см. таблицу), ДА — на 17,7% — в опыте и только на 6,5% — в контроле (см. рис. 1, а), ТМО — на 52,2% в опыте и 41,2% — в контроле (см. рис. 1, б). Увеличилась также вариативность миелиновых волокон, что можно видеть по максимальному значению диаметра миелиновых волокон (см. таблицу). ДА/ДМВ и в опыте, и в контроле снизилось до одинакового значения. Доля ДгВ в опыте удвоилась, но по-прежнему меньше, чем в контроле, и сопоставима с нормой. Через 6 мес после операции по сравнению с предыдущим сроком в контроле не произошло изменений ДМВ, ТМО и максимального диаметра миелиновых волокон, но снизилось число ДА/ДМВ и доля ДгВ, ДА увеличился на 32,1%. В опыте ДМВ увеличился на 4%, ДА — на 40,7%, ТМО — на 6,9%. ДА/ДМВ значительно увеличилось, доля ДгВ возросла. Через 12 мес после операции по сравнению с предыдущим сроком в контроле увеличился ДМВ на 32,1%, ДА — на 8,9%, ТМО — на 20,6%. Вновь увеличилось число ДА/ДМВ и доля ДгВ. В подгруппе ЭС1 ДМВ увеличился на 23,3%, ДА снизился на 12,8%, ТМО увеличилась на 21,1%. ДА/ ДМВ снизилось, увеличилась доля ДгВ. В подгруппе ЭС2 доля ДгВ незначительно больше, чем в ЭС1, и значимо больше, чем в контроле. ДА превысил показатель в контроле на 8,1% (P<0,05), но оказался незначимо меньше, чем в подгруппе ЭС1 (см. таблицу). ТМО по сравнению с таковой в контроле в подгруппе ЭС2 незначимо больше, но значимо меньше (на 9%), чем в группе ЭС1 (см. рис. 1, б). При этом максимальный диаметр волокон в контроле имеет большее значение, а доля ДгВ — меньше, чем в подгруппах ЭС1 и ЭС2 (см. таблицу). Сравнение с параметрами интактного нерва показало, что только в группе ЭС1 произошло приближение значения ДА через 6 мес после операции. Через 12 мес все параметры в контроле и в подгруппах с ЭС значимо отличались от таковых интактного нерва. Распределение миелиновых волокон по диаметру (рис. 2, а) в контроле даже через 12 мес после операции остаётся унимодальным: главный пик располагается в диапазоне 3,1–4 мкм, высота его по сравнению с гистограммой интактного нерва очень значительна. В подгруппах с ЭС отчетливо выражена тенденция к формированию бимодального распределения миелиновых волокон по диаметру (см. рис. 2, б), причём в подгруппе ЭС2 увеличиваются доли волокон среднего (более 5 мкм) и крупного (более 10 мкм) диаметра. Значимость различий между подгруппами ЭС1 и ЭС2, а также каждой из подгрупп с контролем и интактным нервом подтверждается статистически. Обсуждение полученных данных . В исследовании, выполненном нами ранее на небольшом количестве животных, были получены доказательства более продвинутой регенерации СН собаки через 2,5 и 12 мес после его перерезки, микрохирургического шва и одного курса ЭС, проведённого в период от 1 до 2,5 мес, однако даже в конце опыта морфометрический анализ свидетельствовал о значительных различиях регенерировавшего и интактного нерва [8]. Возможность восстановления морфометрических параметров миелиновых волокон после перерезки или раздавливания нерва, вплоть до настоящего времени, остаётся предметом дискуссий, потому что большинство экспериментальных исследований, выполненных с целью разработки способов оптимизации нейрорегенерации, ограничивается оценкой ближайших результатов. Данные по отдалённым результатам, представленные в единичных работах, свидетельствуют, что у крыс диаметры нервных волокон и ТМО остаются сниженными даже через 24 нед после операции [11], и только через 21 мес распределение нервных волокон по диаметру сопоставимо с нормой [13]. По данным J. M. Schröder [15], у собак средний ДА миелиновых волокон через 12 мес после восстановительной операции составил 79%, а ТМО — 57% от таковых в норме; через 24 мес автор не выявил значимого увеличения этих параметров. В нашем исследовании получены очень близкие результаты в контрольной группе (ДА через 12 мес после операции составил 78,9% от такового в норме, а ТМО — 61,6%) и несколько лучшие — в подгруппе ЭС1 (ДА — 87,9%, ТМО — 69,5%). Предположение о том, что в серии с ЭС результаты улучшатся с течением времени — например, через 24 мес после операции, представлялось маловероятным. Поэтому, увеличив количество опытов, мы уточнили динамику морфометрических показателей регенерации в течение первого полугодия после операции, а также оценили отдалённый результат применения повторного курса ЭС. Наиболее существенные факты, установленные в данном исследовании, — значительное увеличение ДА миелиновых регенерирующих волокон в подгруппе с ЭС по сравнению с нестимулированным контролем во все сроки опыта. Отрицательная динамика параметра во втором полугодии после операции, уменьшение вариативности ДМВ, а также значительное увеличение доли волокон с признаками вторичной дегенерации и денервированных эндоневральных трубок, свидетельствовали о более выраженном истощении компенсаторно-приспособительных возможностей нейронов, чем в контроле, хотя ранее выполненные исследования чувствительных узлов спинномозговых нервов у этих животных показали однотипные изменения нейронов в опытах с ЭС и в нестимулированном контроле [7, 10]. Проведение 2-го курса ЭС в период от 6 до 7,5 мес после операции «ухудшило» абсолютный и относительный показатели миелинизации, но увеличило представительство волокон среднего и большого диаметра в регенерирующем нерве. Следует также учесть, что в группе с ЭС, но не в контроле, средний ДА достиг 98% значения интактного нерва уже через 6 мес после операции. Таким образом, однократный курс электротерапии оказывает стимулирующее воздействие на регенерацию и дифференцировку нервных волокон, ускоряя уборку продуктов валлеровской дегенерации и стойко усиливая трофическое обеспечение радиального роста аксонов миелиновых волокон. Однако сопоставимые с контролем темпы миелинизации в период от 4 до 6 мес после операции предопределяют развитие гипомиелинизированного состояния нервных проводников стимулированного регенерирующего нерва и истощение компенсаторно-приспособительных возможностей нейронов к 12 мес после операции, что проявляется уменьшением среднего ДА и повышением доли вторично дегенерировавших волокон. Повторный курс ЭС ухудшает показатели миелинизации и не предотвращает вторичную дегенерацию, но положительным образом модулирует распределение регенерирующих волокон по диаметру.

Об авторах

Наталья Анатольевна Щудло

Российский научный Центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г. А. Илизарова»

клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014 Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Ирина Васильевна Борисова

Российский научный Центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г. А. Илизарова»

клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014 Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Михаил Моисеевич Щудло

Российский научный Центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г. А. Илизарова»

Email: m.m.sch@mail.ru
клинико-экспериментальная лаборатория реконструктивно-восстановительной микрохирургии и хирургии кисти 640014 Курган, ул. М. Ульяновой, 6

Список литературы

Дополнительные файлы