Характеристика пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита

Полный текст

Введение

Лучевой гепатит с развитием радиационно-индуцированной острой печеночной недостаточности считается одним из грозных осложнений радиотерапии злокачественных новообразований (ЗНО) печени, органов брюшной полости или при облучении всего тела [1]. Коллективом авторов было показано, что при воздействии γ-облучения уже в дозе 43 Гр в 50 % случаев развивается постлучевая дисфункция печени, а дозы выше 60 Гр (наиболее часто используемые в клинической практике при ЗНО печени) увеличивают риск летального исхода до 76 % в результате декомпенсации печеночной недостаточности [2], а однократное γ-облучение даже в низкой дозе в эксперименте приводило к апоптозу гепатоцитов [3].

В специализированной литературе существуют данные об эффектах электронов на гепатоциты, однако они единичные и противоречивые [4, 5]. Тем не менее, электронотерапия остается одним из перспективных аналогов более «жестким» видам ионизирующего излучения и может быть использована в качестве способа моделирования лучевого гепатита для поиска и апробации новых средств радиопротекции.

На основании многочисленных исследований, цитотоксическое действие ионизирующего излучения развивается по двум путям – прямому (заряженная частица или волна проходит сквозь молекулу ДНК, формируя одно- и двуцепочечные разрывы) и косвенному (радиолиз внутриклеточных молекул воды приводит к быстрой генерации большого количества свободных радикалов и развитию оксидативного стресса) [6]. Учитывая сложность воздействия на прямой путь внутриклеточного повреждения, большинство исследователей активно изучают возможность влияния на косвенный механизм радиационного повреждения клеток, снижая степень оксидативного стресса путями профилактического (предлучевого) или терапевтического (постлучевого) введения антиоксидантных лекарственных препаратов, одним из которых является аскорбиновая кислота (витамин С) [7].

Пролиферативно-апоптотический баланс гепатоцитов поддерживается главным образом факторами пролиферации (Ki-67) и апоптоза (каспаза-3) [8], а воздействие Х- и γ-ионизирующих излучений доказанно приводит к гибели клеток, преимущественно путем апоптоза (не исключена роль ферроптоза, митохондриально-опосредованного некроза и др.) [9 – 11]. Однако, точные механизмы радиационно-индуцированной гибели клеток печени окончательно не раскрыты, в связи с чем изучение изменений пролиферативно-апоптотического соотношения в структурах печени остается актуальным, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты потенциально может защитить их от воздействия облучения электронами. Полученные данные могут послужить основой дальнейших исследований в области разработки профилактики и лечения лучевого гепатита.

Цель

Иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита.

Материалы и Методы

Крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=40) были поделены на четыре экспериментальные группы:

I – контрольная (n=10), которым вводили раствор NaCl 0,9%;

II (n=10) – фракционное локальное облучение электронами в суммарной облучающей дозе (СОД) 30 Гр;

III (n=10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг / кг за 1 час до локального облучения электронами в СОД 30 Гр;

IV (n=10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг / кг.

Локальное облучение электронами животных проводили на линейном акселераторе «NOVAC-11». Животных всех групп (I – IV) выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика через неделю после последней фракции.  Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Гистологическое исследование.

Фрагменты печени фиксировали в растворе забуференного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы (толщиной 2 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом Leica DM2000 с микрофотосъемкой. Оценивали степень повреждения печени по стандартным критериям в соответствии с адаптированной балльной шкалой Histologic Activity Index (HAI) [12].

Иммуногистохимическое исследование.

В качестве первичных использовали моноклональные антитела к Ki-67 (ThermoFisher, Clone MM1) и Caspase 3 (ThermoFisher, Clone 74T2). Для определения вторичных антител использовались универсальная двухкомпонентная система детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system, («Cell Marque», США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидаза хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ×400 (в %).

Статистическая обработка.

Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнения проводились с использованием дисперсионного анализа. Проведен анализ с использованием теста Крускал-Уоллиса и U-теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

 

Результаты

При гистологическом исследовании в контрольной группе наблюдали нормальное строение печени: радиально отходящие от центральной вены печеночные балки, состоящие из полигональной формы гепатоцитов с ядром в центре; между ними, в синусоидах, – единичные клетки Купфера (по шкале HAI – 0 баллов). Морфологическая картина печени животных IV-ой группы не отличалась от таковой в контрольной группе. Воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр через неделю приводит к формированию мелких кист, развитию баллонной дистрофии гепатоцитов, фокальной атрофии до 2/3 доли печеночных долек, частичного некроза и воспалительной инфильтрации портальных трактов мононуклеарными клетками (по шкале HAI – 9 баллов). Кроме того, отмечали застой и расширение синусоидов, перисинусоидальные геморрагии, гиперплазию клеток Купфера и стенок желчных протоков. В то же время, предлучевое введение аскорбиновой кислоты в III-ей группе уменьшило степень радиационно-индуцированного повреждения печени на основании морфологических критериев. Обнаружили развитие фокальной атрофии, вакуолизации цитоплазмы единичных клеток печени в 1/3 доли печеночных долек, слабой клеточной воспалительной инфильтрации без признаков фиброза (по шкале HAI – 4 балла) (Рис. 1).

При иммуногистохимическом исследовании через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр отмечали снижение пролиферативной и повышение апоптотической активности гепатоцитов в печени II-ой группы, обнаруженное по уменьшению количества позитивных клеток при окрашивании с антителами к Ki-67 (в 1,8 раза) и увеличению доли иммуномеченных на фактор терминации апоптоза каспазу-3 (в 2,1 раза) клеток по сравнению с контрольной группой. В III-ей группе через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр и введения аскорбиновой кислоты наблюдали менее выраженные изменения пролиферативно-апоптотического соотношения: снижение доли Ki-67-иммунопозитивных клеток (в 1,3 раза) и увеличение количества каспаза-3-окрашенных гепатоцитов (в 1,7 раза) по сравнению с контрольными значениями. В то же время, не обнаружили достоверных различий иммуногистохимического паттерна во фрагментах печени IV-ой группы по сравнению с контрольной группой (Табл. 1, Рис. 1).

Обсуждение

Настоящая работа посвящена исследованию пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита, индуцированного фракционным облучением электронами в СОД 30 Гр.

Полученные нами результаты иммуногистохимического исследования с антителами к фактору терминации апоптоза (увеличение доли иммунопозитивных клеток) в сочетании со снижением пролиферативной активности (Ki-67) свидетельствуют о том, что воздействие фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр, вероятно, запускает гибель гепатоцитов путем апоптоза. Существующие исследования подтверждают это предположение, указывая на ключевую роль в механизме радиационно-индуцированного повреждения печени модуляции активности апоптотического каскада (преимущественно, внутренний путь апоптоза) и сигнальных путей PI3K/Akt [13], MAPK, Wnt, семейства TGF-β и др [1, 14]. Согласно некоторым данным, к другим механизмам клеточной гибели (помимо апоптоза) относятся ферроптоз [15], некроз [1], некробиоз, митохондриально-опосредованный некроз [16]. Кроме того, не исключена роль гена FHIT, экспрессия которого, вероятно, способна определять предрасположенность к радиационно-индуцированному повреждению печени [17].

Обнаруженные морфологические (вакуолизация гепатоцитов, пикноз их ядер, воспаление, отек и др.) и иммуногистохимические изменения связаны с активацией прямого (одно- и двуцепочечные разрывы ДНК при ее взаимодействии с электронами) и косвенного (запуск оксидативного стресса ввиду генерации продуктов радиолиза внутриклеточной воды, перекисного окисления липидов и др.) механизмов радиационного повреждения гепатоцитов [6] с развитием острого лучевого гепатита, что не противоречит данным других авторов [1, 14, 18].

В качестве потенциального радиопротектора нами была выбрана аскорбиновая кислота, известная своими антиоксидантными свойствами [19]. Точные механизмы ее эффективности окончательно не раскрыты, однако некоторые авторы предполагают, что это связано со способностью связывать цитотоксические свободные радикалы и индуцировать антиоксидантную защитную систему организма в ответ на радиационное воздействие [7, 20].

В нашем исследовании, предлучевое (профилактическое) введение аскорбиновой кислоты привело к менее выраженному (по сравнению со II-ой группой) смещению пролиферативно-апоптотического соотношения в сторону апоптоза гепатоцитов при иммуногистохимическом окрашивании с антителами к Ki-67 и каспазе-3. Таким образом, глубина и диапазон пострадиационных токсических эффектов в печени оказались снижены, что позволяет нам говорить о возможном протективном действии этого субстрата в печени в ответ на воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр. Не исключено, что аскорбиновая кислота в печени обладает еще и антиапоптотическим действием, однако подтверждение этого предположения требует проведения новых молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований.

Заключение

При иммуногистохимическом исследовании пролиферации и апоптоза гепатоцитов выявили, что через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр происходит снижение митотической активности и увеличение гибели клеток, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты способствовало нивелированию обнаруженных изменений, что указывает на ее протективный эффект.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

 

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

 

Вклад авторов. Г.А. Демяшкин — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, внесение окончательной правки; Д.А. Атякшин — обзор литературы, подготовка и написание текста, внесение окончательной правки; В.А. Якименко — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, написание текста; Д.И. Угурчиева — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание и редактирование текста; М.А. Вадюхин  — сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста; А.А. Абуев — анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution: G.A. Demyashkin - concept and design of the study, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, making final edits; D.A. Atyakshin - literature review, preparation and writing of the text, making final edits; V.A. Yakimenko - concept and design of the study, collection and processing of materials, writing the text; D.I. Ugurchieva - literature review, collection and analysis of literary sources, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, writing and editing the text; M.A. Vadyukhin - collection and processing of materials, analysis of the data obtained, literature review, writing the text; A.A. Abuev - analysis of the data obtained, literature review, writing the text. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a significant contribution to the development of the concept, conduct of the study and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

Таблицы

Таблица 1. Иммуногистохимическая характеристика распределения Ki-67 и каспазы-3 в гепатоцитах контрольной и опытных групп  

Table 1. Immunohistochemical characteristics of the distribution of Ki-67 and caspase-3 in hepatocytes of the control and experimental groups

 

Группа / Group	Ki-67, %	Caspase 3, %
Контроль / Control	22,6±0,8	6,8±0,3
Облучение / Irradiation	12,3±0,4a	14,1±0,6a
Облучение + АК Irradiation + AA	16,9±0,7b	11,7±0,5b
АК / АА	21,9±0,8	6,2±0,3

 

Данные представлены в виде средних значений (диапазон), проведены тест Крускал-Уоллиса и U-тест Манн-Уитни с поправкой Бонферрони. Статистическая достоверные различия по сравнению с контролем в группах Облучение (^а) и Облучение + АК (^b); р <0,05. АК (АА) – аскорбиновая кислота.

 

Рисунки

Рисунок. Печень контрольной и опытных групп. Верхний ряд – окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ), увелич. ×400. Средний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к Ki-67, увелич. ×400. Нижний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к каспазе-3 (Cas 3), увелич. ×400. АК – аскорбиновая кислота. Длина отрезка – 50 мкм. Звездочка – центральная вена, стрелочка – иммуноокрашенные гепатоциты.

Figure. Liver of control and experimental groups. Top row – hematoxylin and eosin (H&E) staining, magn. ×400. Middle row - immunohistochemical picture with antibodies to Ki-67, magn. ×400. Bottom row - immunohistochemical picture with antibodies to caspase-3 (Cas 3), magn. ×400. AA – ascorbic acid. Line – 50 µm. Asterisk – central vein, arrow – immunostained hepatocytes.

Об авторах

Григорий Александрович Демяшкин

Национальный медицинский исследовательский центр радиологии; Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы; Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: dr.grigdem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600
SPIN-код: 5157-0177

док. мед. наук, заведующий отделом патоморфологии НМИЦ Радиологии, Москва, Россия; ведущий научный сотрудник, Научно-образовательный ресурсный центр «Инновационные технологии иммунофенотипирования, цифрового пространственного профилирования и ультраструктурного анализа» РУДН им. Патриса Лумумбы; заведующий лабораторией гистологии и иммуногистохимии ИТМиБ Сеченовского университета

Россия, 125284, Россия, Москва, 2-й Боткинский пр-д, 3; 117198, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6; 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8.

Дмитрий Атякшин

Российский университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

Email: atyakshin-da@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-8347-4556
SPIN-код: 3830-8152

директор, Научно-образовательный ресурсный центр «Инновационные технологии иммунофенотипирования, цифрового пространственного профилирования и ультраструктурного анализа» РУДН им. Патриса Лумумбы

Россия, 117198, Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6

Владислав Якименко

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: Yavladislav87@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2308-6313
SPIN-код: 3572-7563

аспирант ИТМиБ Сеченовского университета

Россия, 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8.

Дали Угурчиева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: daliyagurchieva@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7308-8450

аспирант ИТМиБ Сеченовского университета

Россия, 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8.

Матвей Вадюхин

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020
SPIN-код: 9485-7722

студент института клинической медицины Сеченовского университета

Россия, 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8.

Алихан Абуев

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: abuevv_06@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-9557-4909

студент института клинической медицины Сеченовского университета

Россия, 119991, Россия, Москва, ул. Трубецкая, 8.

Список литературы

Дополнительные файлы