Characteristics of proliferation and apoptosis of hepatocytes after administration of ascorbic acid in a model of radiation hepatitis



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND: Radiation hepatitis with the development of radiation-induced acute liver failure is considered one of the most serious complications of radiotherapy for malignant neoplasms of the liver, abdominal organs, or whole body irradiation. However, the exact mechanisms of radiation-induced liver cell death have not been fully elucidated, and therefore the study of changes in the proliferative-apoptotic ratio in liver structures remains relevant, and pre-irradiation administration of ascorbic acid can potentially protect them from the effects of electron irradiation.

AIM: assessment of proliferation and apoptosis of hepatocytes after administration of ascorbic acid in a model of radiation hepatitis.

METHODS: Wistar rats (Rattus Wistar; n=40) were divided into four experimental groups: I – control (n=10); II (n=10) – fractional irradiation with electrons in a total irradiation dose of 30 Gy; III (n=10) – administration of ascorbic acid before electron irradiation; IV (n=10) – administration of ascorbic acid. Animals of all groups (I – IV) were removed from the experiment a week after the last fraction. Morphological and immunohistochemical (with antibodies to Ki-67 and caspase-3) studies were carried out.

RESULTS: A week after electron irradiation, a sharp decrease in the proportion of Ki-67-positive hepatocytes in combination with an increase in immunolabeling with antibodies to caspase-3 was observed in group II. During the administration of ascorbic acid in group III, less pronounced depth and range of liver damage was noted, confirmed by morphological and immunohistochemical methods (less pronounced decrease in the level of Ki-67 expression and an increase in the proportion of caspase-positive hepatocytes compared to the control) methods.

CONCLUSION: An immunohistochemical study of proliferation and apoptosis of hepatocytes revealed that a week after fractional electron irradiation in SOD 30 Gy, there is a decrease in mitotic activity and an increase in cell death, and pre-irradiation administration of ascorbic acid helped level out the detected changes, which indicates its protective effect.

Full Text

Введение

Лучевой гепатит с развитием радиационно-индуцированной острой печеночной недостаточности считается одним из грозных осложнений радиотерапии злокачественных новообразований (ЗНО) печени, органов брюшной полости или при облучении всего тела [1]. Коллективом авторов было показано, что при воздействии γ-облучения уже в дозе 43 Гр в 50 % случаев развивается постлучевая дисфункция печени, а дозы выше 60 Гр (наиболее часто используемые в клинической практике при ЗНО печени) увеличивают риск летального исхода до 76 % в результате декомпенсации печеночной недостаточности [2], а однократное γ-облучение даже в низкой дозе в эксперименте приводило к апоптозу гепатоцитов [3].

В специализированной литературе существуют данные об эффектах электронов на гепатоциты, однако они единичные и противоречивые [4, 5]. Тем не менее, электронотерапия остается одним из перспективных аналогов более «жестким» видам ионизирующего излучения и может быть использована в качестве способа моделирования лучевого гепатита для поиска и апробации новых средств радиопротекции.

На основании многочисленных исследований, цитотоксическое действие ионизирующего излучения развивается по двум путям – прямому (заряженная частица или волна проходит сквозь молекулу ДНК, формируя одно- и двуцепочечные разрывы) и косвенному (радиолиз внутриклеточных молекул воды приводит к быстрой генерации большого количества свободных радикалов и развитию оксидативного стресса) [6]. Учитывая сложность воздействия на прямой путь внутриклеточного повреждения, большинство исследователей активно изучают возможность влияния на косвенный механизм радиационного повреждения клеток, снижая степень оксидативного стресса путями профилактического (предлучевого) или терапевтического (постлучевого) введения антиоксидантных лекарственных препаратов, одним из которых является аскорбиновая кислота (витамин С) [7].

Пролиферативно-апоптотический баланс гепатоцитов поддерживается главным образом факторами пролиферации (Ki-67) и апоптоза (каспаза-3) [8], а воздействие Х- и γ-ионизирующих излучений доказанно приводит к гибели клеток, преимущественно путем апоптоза (не исключена роль ферроптоза, митохондриально-опосредованного некроза и др.) [9 – 11]. Однако, точные механизмы радиационно-индуцированной гибели клеток печени окончательно не раскрыты, в связи с чем изучение изменений пролиферативно-апоптотического соотношения в структурах печени остается актуальным, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты потенциально может защитить их от воздействия облучения электронами. Полученные данные могут послужить основой дальнейших исследований в области разработки профилактики и лечения лучевого гепатита.

Цель

Иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита.

Материалы и Методы

Крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=40) были поделены на четыре экспериментальные группы:

I – контрольная (n=10), которым вводили раствор NaCl 0,9%;

II (n=10) – фракционное локальное облучение электронами в суммарной облучающей дозе (СОД) 30 Гр;

III (n=10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг / кг за 1 час до локального облучения электронами в СОД 30 Гр;

IV (n=10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг / кг.

Локальное облучение электронами животных проводили на линейном акселераторе «NOVAC-11». Животных всех групп (I – IV) выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика через неделю после последней фракции.  Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Гистологическое исследование.

Фрагменты печени фиксировали в растворе забуференного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы (толщиной 2 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом Leica DM2000 с микрофотосъемкой. Оценивали степень повреждения печени по стандартным критериям в соответствии с адаптированной балльной шкалой Histologic Activity Index (HAI) [12].

Иммуногистохимическое исследование.

В качестве первичных использовали моноклональные антитела к Ki-67 (ThermoFisher, Clone MM1) и Caspase 3 (ThermoFisher, Clone 74T2). Для определения вторичных антител использовались универсальная двухкомпонентная система детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system, («Cell Marque», США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидаза хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ×400 (в %).

Статистическая обработка.

Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнения проводились с использованием дисперсионного анализа. Проведен анализ с использованием теста Крускал-Уоллиса и U-теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

 

Результаты

При гистологическом исследовании в контрольной группе наблюдали нормальное строение печени: радиально отходящие от центральной вены печеночные балки, состоящие из полигональной формы гепатоцитов с ядром в центре; между ними, в синусоидах, – единичные клетки Купфера (по шкале HAI – 0 баллов). Морфологическая картина печени животных IV-ой группы не отличалась от таковой в контрольной группе. Воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр через неделю приводит к формированию мелких кист, развитию баллонной дистрофии гепатоцитов, фокальной атрофии до 2/3 доли печеночных долек, частичного некроза и воспалительной инфильтрации портальных трактов мононуклеарными клетками (по шкале HAI – 9 баллов). Кроме того, отмечали застой и расширение синусоидов, перисинусоидальные геморрагии, гиперплазию клеток Купфера и стенок желчных протоков. В то же время, предлучевое введение аскорбиновой кислоты в III-ей группе уменьшило степень радиационно-индуцированного повреждения печени на основании морфологических критериев. Обнаружили развитие фокальной атрофии, вакуолизации цитоплазмы единичных клеток печени в 1/3 доли печеночных долек, слабой клеточной воспалительной инфильтрации без признаков фиброза (по шкале HAI – 4 балла) (Рис. 1).

При иммуногистохимическом исследовании через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр отмечали снижение пролиферативной и повышение апоптотической активности гепатоцитов в печени II-ой группы, обнаруженное по уменьшению количества позитивных клеток при окрашивании с антителами к Ki-67 (в 1,8 раза) и увеличению доли иммуномеченных на фактор терминации апоптоза каспазу-3 (в 2,1 раза) клеток по сравнению с контрольной группой. В III-ей группе через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр и введения аскорбиновой кислоты наблюдали менее выраженные изменения пролиферативно-апоптотического соотношения: снижение доли Ki-67-иммунопозитивных клеток (в 1,3 раза) и увеличение количества каспаза-3-окрашенных гепатоцитов (в 1,7 раза) по сравнению с контрольными значениями. В то же время, не обнаружили достоверных различий иммуногистохимического паттерна во фрагментах печени IV-ой группы по сравнению с контрольной группой (Табл. 1, Рис. 1).

Обсуждение

Настоящая работа посвящена исследованию пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита, индуцированного фракционным облучением электронами в СОД 30 Гр.

Полученные нами результаты иммуногистохимического исследования с антителами к фактору терминации апоптоза (увеличение доли иммунопозитивных клеток) в сочетании со снижением пролиферативной активности (Ki-67) свидетельствуют о том, что воздействие фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр, вероятно, запускает гибель гепатоцитов путем апоптоза. Существующие исследования подтверждают это предположение, указывая на ключевую роль в механизме радиационно-индуцированного повреждения печени модуляции активности апоптотического каскада (преимущественно, внутренний путь апоптоза) и сигнальных путей PI3K/Akt [13], MAPK, Wnt, семейства TGF-β и др [1, 14]. Согласно некоторым данным, к другим механизмам клеточной гибели (помимо апоптоза) относятся ферроптоз [15], некроз [1], некробиоз, митохондриально-опосредованный некроз [16]. Кроме того, не исключена роль гена FHIT, экспрессия которого, вероятно, способна определять предрасположенность к радиационно-индуцированному повреждению печени [17].

Обнаруженные морфологические (вакуолизация гепатоцитов, пикноз их ядер, воспаление, отек и др.) и иммуногистохимические изменения связаны с активацией прямого (одно- и двуцепочечные разрывы ДНК при ее взаимодействии с электронами) и косвенного (запуск оксидативного стресса ввиду генерации продуктов радиолиза внутриклеточной воды, перекисного окисления липидов и др.) механизмов радиационного повреждения гепатоцитов [6] с развитием острого лучевого гепатита, что не противоречит данным других авторов [1, 14, 18].

В качестве потенциального радиопротектора нами была выбрана аскорбиновая кислота, известная своими антиоксидантными свойствами [19]. Точные механизмы ее эффективности окончательно не раскрыты, однако некоторые авторы предполагают, что это связано со способностью связывать цитотоксические свободные радикалы и индуцировать антиоксидантную защитную систему организма в ответ на радиационное воздействие [7, 20].

В нашем исследовании, предлучевое (профилактическое) введение аскорбиновой кислоты привело к менее выраженному (по сравнению со II-ой группой) смещению пролиферативно-апоптотического соотношения в сторону апоптоза гепатоцитов при иммуногистохимическом окрашивании с антителами к Ki-67 и каспазе-3. Таким образом, глубина и диапазон пострадиационных токсических эффектов в печени оказались снижены, что позволяет нам говорить о возможном протективном действии этого субстрата в печени в ответ на воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр. Не исключено, что аскорбиновая кислота в печени обладает еще и антиапоптотическим действием, однако подтверждение этого предположения требует проведения новых молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований.

Заключение

При иммуногистохимическом исследовании пролиферации и апоптоза гепатоцитов выявили, что через неделю после фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр происходит снижение митотической активности и увеличение гибели клеток, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты способствовало нивелированию обнаруженных изменений, что указывает на ее протективный эффект.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

 

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

 

Вклад авторов. Г.А. Демяшкин — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, внесение окончательной правки; Д.А. Атякшин — обзор литературы, подготовка и написание текста, внесение окончательной правки; В.А. Якименко — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, написание текста; Д.И. Угурчиева — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание и редактирование текста; М.А. Вадюхин  — сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста; А.А. Абуев — анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution: G.A. Demyashkin - concept and design of the study, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, making final edits; D.A. Atyakshin - literature review, preparation and writing of the text, making final edits; V.A. Yakimenko - concept and design of the study, collection and processing of materials, writing the text; D.I. Ugurchieva - literature review, collection and analysis of literary sources, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, writing and editing the text; M.A. Vadyukhin - collection and processing of materials, analysis of the data obtained, literature review, writing the text; A.A. Abuev - analysis of the data obtained, literature review, writing the text. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a significant contribution to the development of the concept, conduct of the study and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

Таблицы

Таблица 1. Иммуногистохимическая характеристика распределения Ki-67 и каспазы-3 в гепатоцитах контрольной и опытных групп  

Table 1. Immunohistochemical characteristics of the distribution of Ki-67 and caspase-3 in hepatocytes of the control and experimental groups

 

Группа / Group

Ki-67, %

Caspase 3, %

Контроль / Control

22,6±0,8

6,8±0,3

Облучение / Irradiation

12,3±0,4a

14,1±0,6a

Облучение + АК

Irradiation + AA

16,9±0,7b

11,7±0,5b

АК / АА

21,9±0,8

6,2±0,3

 

Данные представлены в виде средних значений (диапазон), проведены тест Крускал-Уоллиса и U-тест Манн-Уитни с поправкой Бонферрони. Статистическая достоверные различия по сравнению с контролем в группах Облучение (а) и Облучение + АК (b); р <0,05. АК (АА) – аскорбиновая кислота.

 

Рисунки

Рисунок. Печень контрольной и опытных групп. Верхний ряд – окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ), увелич. ×400. Средний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к Ki-67, увелич. ×400. Нижний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к каспазе-3 (Cas 3), увелич. ×400. АК – аскорбиновая кислота. Длина отрезка – 50 мкм. Звездочка – центральная вена, стрелочка – иммуноокрашенные гепатоциты.

Figure. Liver of control and experimental groups. Top row – hematoxylin and eosin (H&E) staining, magn. ×400. Middle row - immunohistochemical picture with antibodies to Ki-67, magn. ×400. Bottom row - immunohistochemical picture with antibodies to caspase-3 (Cas 3), magn. ×400. AA – ascorbic acid. Line – 50 µm. Asterisk – central vein, arrow – immunostained hepatocytes.

×

About the authors

Grigory A. Demyashkin

National Medical Research Center for Radiology; RUDN University; First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: dr.grigdem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600
SPIN-code: 5157-0177

Doc. Med. Sci., Head of the Department of Pathomorphology, National Medical Research Center of Radiology, Moscow, Russia; Leading Researcher, Scientific and Educational Resource Center "Innovative Technologies of Immunophenotyping, Digital Spatial Profiling and Ultrastructural Analysis" RUDN University named after Patrice Lumumba; Head of the Laboratory of Histology and Immunohistochemistry, ITMB Sechenov University

Russian Federation, 125284, Russia, Moscow, 2nd Botkinsky pr-d, 3; 117198, Russia, Moscow, st. Miklouho-Maclay, 6; 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8.

Dmitry Atyakshin

RUDN University

Email: atyakshin-da@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-8347-4556
SPIN-code: 3830-8152

Director, Scientific and Educational Resource Center “Innovative Technologies of Immunophenotyping, Digital Spatial Profiling and Ultrastructural Analysis” RUDN University named after Patrice Lumumba

Russian Federation, 117198, Russia, Moscow, st. Miklouho-Maclay, 6

Vladislav Yakimenko

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: Yavladislav87@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2308-6313
SPIN-code: 3572-7563

graduate student of ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8.

Dali Ugurchieva

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: daliyagurchieva@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7308-8450

graduate student of ITM&B of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8.

Matvey Vadyukhin

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020
SPIN-code: 9485-7722

student at the Institute of Clinical Medicine of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8.

Alikhan Abuev

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: abuevv_06@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-9557-4909

student at the Institute of Clinical Medicine of Sechenov University

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, st. Trubetskaya, 8.

References

  1. Zhu W., Zhang X., Yu M. Radiation-induced liver injury and hepatocyte senescence // Cell Death Discov. 2021. Vol. 7. P. 244. doi: 10.1038/s41420-021-00634-6
  2. Yang W., Shao L., Zhu S. Transient Inhibition of mTORC1 Signaling Ameliorates Irradiation-Induced Liver Damage // Front Physiol. 2019. Vol. 10. P. 228. doi: 10.3389/fphys.2019.00228
  3. Abdel-Aziz N., Haroun R.A., Mohamed H.E. Low-Dose Gamma Radiation Modulates Liver and Testis Tissues Response to Acute Whole Body Irradiation // Dose Response. 2022. Vol. 20. № 2. Р. 15593258221092365. doi: 10.1177/15593258221092365
  4. Gridley D.S., Freeman T.L., Makinde A.Y. Comparison of proton and electron radiation effects on biological responses in liver, spleen and blood // Int J Radiat Biol. 2011. Vol. 87. № 12. P. 1173-1181. doi: 10.3109/09553002.2011.624393
  5. Wang L., Liu Y., Rong W. The role of intraoperative electron radiotherapy in centrally located hepatocellular carcinomas treated with narrow-margin (<1 cm) hepatectomy: a prospective, phase 2 study // Hepatobiliary Surg Nutr. 2022. Vol. 11. № 4. P. 515-529. doi: 10.21037/hbsn-21-223
  6. Reisz J.A., Bansal N., Qian J., Zhao W., Furdui C.M. Effects of ionizing radiation on biological molecules--mechanisms of damage and emerging methods of detection // Antioxid Redox Signal. 2014. Vol. 21. № 2. P. 260-292. doi: 10.1089/ars.2013.5489
  7. Attia A.A., Hamad H.A., Fawzy M.A. The Prophylactic Effect of Vitamin C and Vitamin B12 against Ultraviolet-C-Induced Hepatotoxicity in Male Rats // Molecules. 2023. Vol. 28. № 11. P. 4302.
  8. Salama Y.A., El-Karef A., El Gayyar A.M., Abdel-Rahman N. Beyond its antioxidant properties: Quercetin targets multiple signalling pathways in hepatocellular carcinoma in rats // Life Sci. 2019. Vol. 236. P. 116933. doi: 10.1016/j.lfs.2019.116933
  9. Jiao Y., Cao F., Liu H. Radiation-induced Cell Death and Its Mechanisms // Health Phys. 2022. Vol. 123. № 5. P. 376-386. doi: 10.1097/HP.0000000000001601
  10. Cao X., Wen P., Fu Y. Radiation induces apoptosis primarily through the intrinsic pathway in mammalian cells // Cell Signal. 2019. Vol. 62. P. 109337. doi: 10.1016/j.cellsig.2019.06.002
  11. Gary A.S., Rochette P.J. Apoptosis, the only cell death pathway that can be measured in human diploid dermal fibroblasts following lethal UVB irradiation // Sci Rep. 2020. Vol. 10. P. 18946. doi: 10.1038/s41598-020-75873-1
  12. Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. 1981. Vol. 1. № 5. P. 431-435. doi: 10.1002/hep.1840010511
  13. Xiao L., Zhang H., Yang X. Role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway in radiation-induced liver injury // Kaohsiung J Med Sci. 2020. Vol. 36. № 12. P. 990-997. doi: 10.1002/kjm2.12279
  14. Zhou Y.J., Tang Y., Liu S.J. Radiation-induced liver disease: beyond DNA damage // Cell Cycle. 2023. Vol. 22. № 5. P. 506-526. doi: 10.1080/15384101.2022.2131163
  15. Ji Q., Fu S., Zuo H. ACSL4 is essential for radiation-induced intestinal injury by initiating ferroptosis // Cell Death Discov. 2022. Vol. 8. № 1. P. 332. doi: 10.1038/s41420-022-01127-w
  16. Averbeck D., Rodriguez-Lafrasse C. Role of Mitochondria in Radiation Responses: Epigenetic, Metabolic, and Signaling Impacts // Int J Mol Sci. 2021. Vol. 22. № 20. P. 11047. doi: 10.3390/ijms222011047
  17. Nakajima T., Ninomiya Y., Nenoi M. Radiation-Induced Reactions in the Liver—Modulation of Radiation Effects by Lifestyle-Related Factors // International Journal of Molecular Sciences. 2018. Vol. 19. № 12. P. 3855. doi: 10.3390/ijms19123855
  18. Li T., Cao Y., Li B., Dai R. The biological effects of radiation-induced liver damage and its natural protective medicine // Prog Biophys Mol Biol. 2021. Vol. 167. P. 87-95. doi: 10.1016/j.pbiomolbio.2021.06.012
  19. Gęgotek A., Skrzydlewska E. Antioxidative and Anti-Inflammatory Activity of Ascorbic Acid // Antioxidants. 2022. Vol. 11. № 10. P. 1993. doi: 10.3390/antiox11101993
  20. Smith T.A., Kirkpatrick D.R., Smith S. Radioprotective agents to prevent cellular damage due to ionizing radiation // J Transl Med. 2017. Vol. 15. P. 232. doi: 10.1186/S12967-017-1338-X

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 0110212 от 08.02.1993.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies