Characteristics of proliferation and apoptosis of hepatocytes after administration of ascorbic acid in a model of radiation hepatitis

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Лучевой гепатит с развитием радиационно-индуцированной острой печёночной недостаточности считается одним из грозных осложнений радиотерапии злокачественных новообразований печени, органов брюшной полости или при облучении всего тела [1]. Коллективом авторов показано, что при воздействии γ-облучения уже в дозе 43 Гр в 50% случаев развивается постлучевая дисфункция печени, дозы выше 60 Гр (наиболее часто используемые в клинической практике для терапии злокачественных новообразований печени) увеличивают риск летального исхода до 76% в результате декомпенсации печёночной недостаточности [2], а однократное γ-облучение даже в низкой дозе в эксперименте приводит к апоптозу гепатоцитов [3].

В специализированной литературе существуют данные об эффектах электронов на гепатоциты, однако они единичные и противоречивые [4, 5]. Тем не менее электронотерапия остаётся одним из перспективных аналогов более «жёстким» видам ионизирующего излучения и может быть использована в качестве способа моделирования лучевого гепатита для поиска и апробации новых средств радиопротекции.

По данным многочисленных исследований, цитотоксическое действие ионизирующего излучения развивается по двум путям: прямому (заряжённая частица или волна проходит сквозь молекулу ДНК, формируя одно- и двуцепочечные разрывы) и косвенному (радиолиз внутриклеточных молекул воды приводит к быстрой генерации большого количества свободных радикалов и развитию оксидативного стресса) [6]. Учитывая сложность воздействия на прямой путь внутриклеточного повреждения, большинство исследователей активно изучают возможность влияния на косвенный механизм радиационного повреждения клеток, снижая степень оксидативного стресса с помощью профилактического (предлучевого) или терапевтического (постлучевого) введения антиоксидантных лекарственных препаратов, одним из которых является аскорбиновая кислота (витамин С) [7]. Это вещество обладает доказанной антиоксидантной активностью, вероятно обусловленной способностью к связыванию свободных радикалов (продуктов ионизации молекул воды, продуктов перекисного окисления жирных кислот, активных форм кислорода и реактивных форм азота), а также к стимуляции участников эндогенной антиоксидантной системы: клеточных антиоксидантов (глутатион, тиоредоксин, коэнзим Q) и ферментов (супероксиддисмутаза, глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза и др.) [8].

Пролиферативно-апоптотический баланс гепатоцитов поддерживается главным образом факторами пролиферации (Ki-67) и апоптоза (каспаза-3) [9], а воздействие Х- и γ-ионизирующих излучений приводит к гибели клеток, преимущественно путём апоптоза (не исключена роль ферроптоза, митохондриально-опосредованного некроза и др.) [10–12]. Однако точные механизмы радиационно-индуцированной гибели клеток печени окончательно не раскрыты, в связи с чем изучение изменений пролиферативно-апоптотического соотношения в структурах печени остаётся актуальным, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты потенциально может защитить эти структуры от воздействия облучения электронами.

Цель исследования — иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза гепатоцитов после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В эксперименте участвовали крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=40), которых разделили на четыре экспериментальные группы:

• I — контрольная (n=10), вводили 0,9% раствор NaCl;
• II (n=10) — проводили фракционное локальное облучение электронами в суммарной очаговой дозе (СОД) 30 Гр;
• III (n=10) — интраперитонеально вводили аскорбиновую кислоту в дозе 50 мг/кг за 1 ч до локального облучения электронами в СОД 30 Гр;
• IV (n=10) — интраперитонеально вводили аскорбиновую кислоту в дозе 50 мг/кг.

Локальное облучение животных электронами выполняли на линейном акселераторе NOVAC-11 (S.I.T. — Sordina IORT Technologies S.p.A., Италия). Животных всех групп выводили из эксперимента путём введения высоких доз анестетика через неделю после последней фракции. Все манипуляции выполняли согласно Международным рекомендациям (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2013).

Гистологическое исследование

Фрагменты печени фиксировали в растворе забуференного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы толщиной 2 мкм, депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом Leica DM2000 (Leica Microsystems, Германия) с микрофотосъёмкой. Оценивали степень повреждения печени по стандартным критериям в соответствии с адаптированной балльной шкалой Histologic Activity Index (HAI) [13].

Иммуногистохимическое исследование

В качестве первичных использовали моноклональные антитела к Ki-67 (clone MM1; Thermo Fisher Scientific, США) и каспазе-3 (clone 74T2; Thermo Fisher Scientific, США). Для определения вторичных антител применяли универсальную двухкомпонентную систему детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system (Cell Marque, США), анти-IGG мыши/кролика, пероксидазу хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчёт количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при ×400 (в процентах).

Статистическая обработка

Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Для проверки равенства медиан проводили тест Краскела–Уоллиса. Для оценки нормальности распределения использовали критерий Д’Агостино. При нормальном распределении применяли t-тест Стьюдента. Сравнения проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. При ненормальном распределении применяли тест Манна–Уитни. Значение p <0,05 считали статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При гистологическом исследовании в контрольной группе наблюдали нормальное строение печени: радиально отходящие от центральной вены печёночные балки, состоящие из полигональной формы гепатоцитов с ядром в центре; между ними, в синусоидах, — единичные клетки Купфера (по шкале HAI — 0 баллов). Морфологическая картина печени животных IV группы не отличалась от таковой в контрольной группе. Установлено, что воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр через неделю приводит к формированию мелких кист, развитию баллонной дистрофии гепатоцитов, фокальной атрофии до 2/3 доли печёночных долек, частичного некроза и воспалительной инфильтрации портальных трактов мононуклеарными клетками (по шкале HAI — 9 баллов). Кроме того, отмечали застой и расширение синусоидов, перисинусоидальные геморрагии, гиперплазию клеток Купфера и стенок желчных протоков. В то же время предлучевое введение аскорбиновой кислоты в III группе уменьшило степень радиационно-индуцированного повреждения печени на основании морфологических критериев. Обнаружено развитие фокальной атрофии, вакуолизации цитоплазмы единичных клеток печени в 1/3 доли печёночных долек, слабой клеточной воспалительной инфильтрации без признаков фиброза (по шкале HAI — 4 балла) (рис. 1).

 

Рис. 1. Печень контрольной и опытных групп: верхний ряд — окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ), ×400; средний ряд — иммуногистохимическая картина с антителами к Ki-67, ×400; нижний ряд — иммуногистохимическая картина с антителами к каспазе-3 (Cas-3), ×400. АК — аскорбиновая кислота. Бар — 50 мкм. Звёздочкой обозначена центральная вена, стрелка указывает на иммуноокрашенные гепатоциты

Fig. 1. Liver of control and experimental groups: top row — hematoxylin and eosin (H&E) staining, ×400; middle row — immunohistochemical picture with antibodies to Ki-67, ×400; bottom row — immunohistochemical picture with antibodies to caspase-3 (Cas-3), ×400. AA — ascorbic acid. Line — 50 µm. Asterisk indicates central vein, arrow indicates immunostained hepatocytes

 

В образцах контрольной группы при иммуногистохимическом исследовании отмечали окрашивание единичных гепатоцитов с антителами к Ki-67 (5,7±0,2%) и каспазе-3 (6,4±0,3%), а также некоторых непаренхиматозных клеток (клеток фибробластического ряда, эндотелиоцитов и др.). Фракционное облучение электронами в СОД 30 Гр привело к смещению пролиферативно-апоптотического соотношения в сторону снижения митотической активности и увеличения клеточной гибели гепатоцитов, что подтверждалось изменением уровней иммуномечения на Ki-67 (2,6±0,1%; р <0,05) и каспазу-3 (12,5±0,6%; р <0,05) по сравнению с контрольной группой. Во II группе наблюдали незначительное увеличение доли Ki-67- и каспаза-3-окрашенных клеток фибробластического ряда, эндотелия синусоидов и кровеносных сосудов мелкого и среднего калибров. Введение аскорбиновой кислоты перед фракционным облучением электронами в СОД 30 Гр привело к менее выраженному пролиферативно-апоптотическому дисбалансу гепатоцитов, согласно иммуногистохимическим реакциям на Ki-67 (3,3±0,1%; р <0,05) и каспазу-3 (10,3±0,5%; р <0,05), по сравнению с контрольной группой. Окрашивание непаренхиматозных клеток печени в этой группе практически не отличалось от контрольных значений. Статистически значимых различий иммуногистохимического паттерна во фрагментах печени крыс IV группы по сравнению с контролем не обнаружено (см. рис. 1, рис. 2).

 

Рис. 2. Пролиферативно-апоптотический баланс гепатоцитов контрольной и опытных групп (%) по результатам иммуногистохимических реакций с антителами к Ki-67 и каспазе-3. Данные представлены в виде средних значений (диапазон); * статистически значимые различия по сравнению с контролем в группах «Облучение» и «Облучение + АК»; р <0,05. АК — аскорбиновая кислота

Fig. 2. Proliferation and apoptosis of hepatocytes in the control and experimental groups according to the results of immunohistochemistry with antibodies to Ki-67 and caspase-3. Data are presented as means (range); * statistically significant differences compared to the control in the “Irradiation” and “Irradiation + AA” groups; p <0.05. АА — ascorbic acid

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты иммуногистохимического исследования с антителами к фактору терминации апоптоза (увеличение доли иммунопозитивных клеток) в сочетании со снижением пролиферативной активности (Ki-67) свидетельствуют о том, что воздействие фракционного облучения электронами в СОД 30 Гр, по всей вероятности, запускает гибель гепатоцитов путём апоптоза. Существующие исследования подтверждают это предположение, указывая на ключевую роль в механизме радиационно-индуцированного повреждения печени модуляции активности апоптотического каскада (преимущественно внутренний путь апоптоза) и сигнальных путей PI3K/Akt [14], MAPK, Wnt, семейства TGF-β и др. [1, 15]. Согласно некоторым данным, к другим механизмам клеточной гибели, помимо апоптоза, относятся ферроптоз [16], некроз [1], некробиоз, митохондриально-опосредованный некроз [17]. Кроме того, не исключена роль гена FHIT, экспрессия которого, по всей вероятности, способна определять предрасположенность к радиационно-индуцированному повреждению печени [18].

Обнаруженные морфологические (вакуолизация гепатоцитов, пикноз их ядер, воспаление, отёк и др.) и иммуногистохимические изменения связаны с активацией прямого (одно- и двуцепочечные разрывы ДНК при её взаимодействии с электронами) и косвенного (запуск оксидативного стресса ввиду генерации продуктов радиолиза внутриклеточной воды, перекисного окисления липидов и др.) механизмов радиационного повреждения гепатоцитов [6] на фоне развития острого лучевого гепатита, что не противоречит данным других авторов [1, 15, 19].

В качестве потенциального радиопротектора нами была выбрана аскорбиновая кислота, известная своими антиоксидантными свойствами [8]. Точные механизмы её эффективности окончательно не раскрыты, однако некоторые авторы предполагают, что эффективность обусловлена способностью связывать цитотоксические свободные радикалы и индуцировать антиоксидантную защитную систему организма в ответ на радиационное воздействие [7, 20].

В нашем исследовании предлучевое (профилактическое) введение аскорбиновой кислоты привело к менее выраженному (по сравнению со II группой) смещению пролиферативно-апоптотического соотношения в сторону апоптоза гепатоцитов при иммуногистохимическом окрашивании с антителами к Ki-67 и каспазе-3. Таким образом, глубина и диапазон пострадиационных токсических эффектов в печени оказались снижены, что позволяет нам говорить о возможном протективном действии этого субстрата в печени в ответ на воздействие фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр. Не исключено, что аскорбиновая кислота в печени обладает ещё и антиапоптотическим действием, однако подтверждение этого предположения требует новых молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При иммуногистохимическом исследовании пролиферации и апоптоза в печени выявили, что через неделю после фракционного облучения электронами в суммарной очаговой дозе 30 Гр происходит снижение митотической активности и увеличение числа погибших гепатоцитов, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты способствует нивелированию обнаруженных изменений, что указывает на её протективный эффект. Полученные данные могут послужить основой дальнейших исследований в области разработки способов профилактики и лечения лучевого гепатита.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Г.А. Демяшкин — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, внесение окончательной правки; Д.А. Атякшин — обзор литературы, подготовка и написание текста, внесение окончательной правки; В.А. Якименко — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, написание текста; Д.И. Угурчиева — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание и редактирование текста; М.А. Вадюхин — сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста; А.А. Абуев — анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

G.A. Demyashkin — concept and design of the study, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, making final edits; D.A. Atyakshin — literature review, preparation and writing of the text, making final edits; V.A. Yakimenko — concept and design of the study, collection and processing of materials, writing the text; D.I. Ugurchieva — literature review, collection and analysis of literary sources, collection and processing of materials, analysis of the data obtained, writing and editing the text; M.A. Vadyukhin — collection and processing of materials, analysis of the data obtained, literature review, writing the text; A.A. Abuev — analysis of the data obtained, literature review, writing the text.

About the authors

Grigory A. Demyashkin

National Medical Research Radiological Centre; Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: dr.dga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600
SPIN-code: 5157-0177

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

Dmitry A. Atyakshin

Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba

Email: atyakshin-da@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-8347-4556
SPIN-code: 3830-8152
Russian Federation, Moscow

Vladislav A. Yakimenko

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: Yavladislav87@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2308-6313
SPIN-code: 3572-7563
Russian Federation, Moscow

Dali I. Ugurchieva

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: daliyagurchieva@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7308-8450
Russian Federation, Moscow

Matvey A. Vadyukhin

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020
SPIN-code: 9485-7722
Russian Federation, Moscow

Alikhan A. Abuev

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: abuevv_06@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-9557-4909
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files