Влияние пола и степени недоношенности на морфологию сердца в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза

Полный текст

Обоснование

Заболевания сердечно-сосудистой системы являются одной из основных причин сокращения продолжительности жизни людей во всем мире [1]. Установлено, что у преждевременно рожденных людей повышен риск более раннего развития заболеваний сердца [2]. По результатам клинических исследований на сегодняшний день невозможно сделать однозначный вывод о влиянии пола и степени недоношенности на структуру сердца людей, рожденных преждевременно [2, 3]. Обобщение результатов клинических исследований осложняется разнородностью исследуемого контингента. В ряде исследований разделение недоношенных на подгруппы в соответствии с полом, степенью недоношенности, а также соответствием массы тела на момент рождения гестационному возрасту отсутствует [4]. Показано, что на выраженность структурных изменений сердца преждевременно рожденных людей потенциально может оказывать влияние неонатальная терапия и тип вскармливания, что также необходимо учитывать при интерпретации результатов клинических исследований [5]. Вышеизложенное доказывает актуальность экспериментального исследования структурных изменений миокарда у преждевременно рожденных животных, служащих предикторами раннего развития заболеваний сердца.

Цель

Дать морфологическую характеристику левого желудочка сердца преждевременно рожденных крыс на 42-180 сутки постнатального периода онтогенеза с учетом пола и степени недоношенности.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Эксперимент проведен на преждевременно рожденных и доношенных самцах и самках крыс Вистар. Все животные, использованные в эксперименте, получены от интактных самцов (2 мес, 180±20 г) и самок (3 мес, 180±20 г) крыс Вистар. Самца подсаживали к самке, находящейся в стадии проэструса, на ночь, после чего для верификации коитуса проводили анализ влагалищного мазка. При обнаружении в мазке сперматозоидов, считали этот день первым днем беременности крыс. Для получения недоношенного потомства, преждевременные роды индуцировали подкожным введением 1 мл мифепристона в дозе 10 мг на 1 кг массы тела (Sigma-Aldrich, США). Поскольку инъекция мифепристона приводит к началу родов у крыс через 18-24 ч [6], для индукции родов на 21,5 сутки и 21 сутки, мифепристон вводили на 20,5 и 20 сутки беременности, соответственно. Таким образом, контрольную группу составили доношенные животные, продолжительность внутриутробного периода которых – 22 суток. 1-ая группа сформирована преждевременно рожденными животными, с продолжительностью внутриутробного периода 21,5 суток (недоношенность на 12 ч). 2-ая группа сформирована преждевременно рожденными животными, с продолжительностью внутриутробного периода 21 суток (недоношенность на 24 ч).

Все крысы содержались в стандартных условиях вивария. Животных выводили из эксперимента асфиксией СО₂ на 42, 56 и 180 сутки постнатального периода онтогенеза. Всего в исследовании использованы 72 крысы: каждая группа включала 24 животных, в числе которых 12 самцов и 12 самок, по 4 животных каждого пола на каждый экспериментальный срок.

Морфологическое исследование

Сердце крыс фиксировали 24 ч в 10%-ном формалине (pH=7,4) для последующей заливки в парафиновые блоки. На автоматическом микротоме HM355S (Thermo Fisher Scientific, Китай) получали поперечные срезы сердца (толщина 5 мкм) на уровне сосочковых мышц. Срезы окрашивали гематоксилином Джилла (Биовитрум, Россия) и эозином (Биовитрум, Россия), а также использовали для иммуногистохимического выявления активированной каспазы 3 (маркер апоптоза). В качестве первичных антител использовали #9961 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Cell Signlling Technology, США). Постановку и визуализацию иммуногистохимической реакции проводили с использованием набора Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit (Abcam, Великобритания). Гистологические и иммуногистохимические препараты сердца изучали при помощи светового микроскопа Axioscope 40 (Zeiss, Германия). На фотографиях препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в программе ImageJ 1.48 (NIH, США) измеряли толщину стенки левого желудочка (3 измерения для каждого животного), диаметр кардиомиоцитов (в 20 клетках у каждого животного), а также определяли удельный объем кардиомиоцитов методом точечного счета (5 измерений для каждого животного). На иммуногистохимических препаратах подсчитывали количество каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов в 1 мм² миокарда левого желудочка крыс (5 измерений для каждого животного).

Статистический анализ

Статистическую обработку морфометрических данных осуществляли в SPSS 17.0. Проверку распределения количественных параметров на нормальность осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку выборки не соответствовали нормальному закону распределения, для установления различий между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ (критерий Краскела-Уоллиса). При выявлении в ходе однофакторного дисперсионного анализа межгрупповых различий, проводили попарное сравнение с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде медианы и квартилей – Мe (Q₁; Q₃), достигнутый уровень значимости обозначен – р. Различия считали значимыми при р<0,01.

Этическая экспертиза

Исследование выполнено при соблюдении Федерального Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (№ 8475/1 от 30.11.2020).

Результаты

Индукция у грызунов преждевременных родов мифепристоном является общепризнанной моделью недоношенности [6]. В настоящем исследовании введение мифепристона во всех случаях приводило к преждевременным родам крыс.

Для оценки полоспецифичных эффектов преждевременного рождения на строение сердца, исследование проведено на крысах обоего пола в период полового созревания и половой зрелости. Чтобы было возможным оценить влияние степени недоношенности на строение сердца, выделены две группы преждевременно рожденных животных с различной продолжительностью внутриутробного периода развития.

Стенка левого желудочка сердца преждевременно рожденных и доношенных животных на 42-180 сутки постнатального периода онтогенеза имеет принципиально схожее строение (рис. 1 A-C). Миокард образован двуядерными кардиомиоцитами, окруженными обильно васкуляризованным интерстицием. Обращает на себя внимание гиперемия кровеносных капилляров миокарда самцов и самок крыс всех исследуемых групп. Толщина стенки левого желудочка, а также диаметр сократительных кардиомиоцитов самцов и самок крыс контрольной, 1-ой и 2-ой групп увеличивается в ходе постнатального периода онтогенеза. Преждевременное рождение не приводит к увеличению данных показателей в сердце самцов и самок крыс с 42 по 180 сутки постнатального периода онтогенеза (табл. 1).

Удельный объем кардиомиоцитов левого желудочка животных всех исследуемых групп с 42 по 180 сутки постнатального периода онтогенеза является стабильным показателем. Снижение данного показателя на 56 сутки, по сравнению с аналогичным показателем на 42 сутки постнатального периода онтогенеза, наблюдается только у самок крыс контрольной группы. Преждевременное рождение независимо от пола приводит к снижению удельного объема кардиомиоцитов левого желудочка с 42 по 180 сутки постнатального периода онтогенеза. Более выраженное снижение удельного объема кардиомиоцитов левого желудочка наблюдается у животных 1-ой группы (табл. 1).

Чтобы оценить интенсивность апоптоза в миокарде левого желудочка преждевременно рожденных животных, проведено иммуногистохимическое выявление активированной каспазы 3. У самцов и самок крыс контрольной и 1-ой групп в левом желудочке единичные каспаза 3-позитивные кардиомиоциты обнаруживаются на 180 сутки постнатального периода онтогенеза (рис. 1 D-F). Однако при большей степени недоношенности, у самцов и самок крыс 2-ой группы, каспаза 3-позитивные кардиомиоциты определяются в левом желудочке, начиная с 56 суток постнатального периода онтогенеза. Cтатистически значимое увеличение количества каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов показано исключительно в левом желудочке самцов крыс 2-ой группы (табл. 1).

Обсуждение

Наблюдаемое в ходе эксперимента у крыс всех групп увеличение толщины стенки левого желудочка и диаметра кардиомиоцитов в ней является следствием роста животных и увеличения гемодинамических нагрузок. У преждевременно рожденных крыс нами, в отличие от Lewandowski et al. [7] и Bertagnolli et al. [8], не обнаружено признаков гипертрофии левого желудочка, таких как увеличение толщины его стенки и диаметра кардиомиоцитов. Преждевременное рождение крыс независимо от пола и степени недоношенности не приводит к развитию гипертрофии левого желудочка сердца на 42-180 сутки постнатального периода онтогенеза.

Снижение удельного объема кардиомиоцитов, наблюдаемое в левом желудочке у преждевременно рожденных животных, в первую очередь связано с развитием интерстициального фиброза [8] как ответной реакции на повышенные гемодинамические нагрузки [9], однако отчасти может быть обусловлено интенсификацией апоптоза кардиомиоцитов. Известно, что невысокий, но стабильный уровень апоптоза кардиомиоцитов может приводить к функциональной недостаточности сердца [10]. Примечательно, что меньшая степень недоношенности не приводит к увеличению количества каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов как у самцов, так и у самок крыс на 42-180 сутки постнатального периода онтогенеза. При большей степени недоношенности у самцов, но не у самок крыс, наблюдается увеличение количества каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов на 56 сутки постнатального периода онтогенеза.

Возможной причиной увеличения количества каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов у преждевременно рожденных крыс являются продемонстрированные нами ранее трофические нарушения в левом желудочке [11]. Снижение у крыс удельного объема кровеносных капилляров и трофического индекса миокарда на 56 и 180 сутки постнатального периода онтогенеза также наблюдалось исключительно при большей степени недоношенности [11]. Гиперемия сосудов микроциркуляторного русла наблюдается в сердце как доношенных, так и преждевременно рожденных животных, и является, вероятно, следствием использования СО₂ для умерщвления животных.

Стоит отметить, что проведенное исследование не дает представления об интенсивности других форм клеточной гибели кардиомиоцитов (некроз, аутофагическая гибель и др.) преждевременно рожденных животных.

Заключение

Таким образом, продемонстрировано влияние степени недоношенности и пола на количество каспаза 3-позитивных кардиомиоцитов левого желудочка преждевременно рожденных крыс в отдаленном постнатальном периоде онтогенеза. Полученные результаты свидетельствуют о различном компенсаторно-адаптационном потенциале миокарда животных при разной степени недоношенности. Результаты исследования позволяют предположить кардиопротективное влияние женских половых стероидов у преждевременно рожденных животных.

Таблица 1. Динамика морфометрических параметров левого желудочка сердца преждевременно рожденных крыс

Table 1. Dynamics of heart left ventricle morphometric parameters of preterm born rats

Примечание: * отличие от показателя животных этой же группы на предыдущий срок; ** отличие от показателя самцов крыс этой же группы; † отличие от показателя крыс контрольной группы; †† отличие от показателя крыс 1-ой группы; р – уровень значимости

Подписи к рисункам

Рисунок 1. Миокард левого желудочка самцов крыс контрольной, 1-ой и 2-ой групп, 180 сутки постнатального периода онтогенеза. Окраска гематоксилином и эозином, ×400 (A-C). Иммуногистохимическое выявление активированной каспазы 3, докраска гематоксилином Джилла, ×630 (D-F). Стрелка указывает на иммунопозитивные кардиомиоциты.

Figure 1. Left ventricle myocardium of male rats of the control, 1st and 2nd groups, 180 days of the postnatal period of ontogenesis. Hematoxylin and eosin staining, ×400 (A-C). Immunohistochemical detection of activated caspase 3, staining with Gill's hematoxylin, ×630 (D-F). The arrow points to immunopositive cardiomyocytes.

Об авторах

Вера Владимировна Иванова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivvera92@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-2530-1112
SPIN-код: 9476-3329
Scopus Author ID: 55265928000
ResearcherId: O-4180-2016

кандидат биологических наук, доцент кафедры морфологии и общей патологии

Список литературы

Дополнительные файлы