Influence of sex and degree of prematurity on the heart structure in the late postnatal period of ontogenesis

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Патологии сердечно-сосудистой системы занимают лидирующее место в структуре заболеваемости и смертности людей во всём мире [1]. Установлено, что у преждевременно рождённых людей повышен риск более раннего развития заболеваний сердца [2]. По результатам клинических исследований на сегодняшний день невозможно сделать однозначный вывод о влиянии пола и степени недоношенности на структуру сердца людей, рождённых преждевременно [2, 3]. Обобщение результатов таких исследований осложняется разнородностью исследуемого контингента. В ряде работ разделение недоношенных на подгруппы в соответствии с полом, степенью недоношенности, а также с учётом соответствия массы тела на момент рождения гестационному возрасту отсутствует [4]. Показано, что на выраженность структурных изменений сердца преждевременно рождённых людей потенциально может оказывать влияние неонатальная терапия и тип вскармливания. Это также необходимо учитывать при интерпретации результатов клинических исследований [5]. Вышеизложенное доказывает актуальность экспериментального исследования структурных изменений миокарда, служащих предикторами раннего развития заболеваний сердца, у преждевременно рождённых животных.

Цель исследования — дать характеристику структуры левого желудочка сердца преждевременно рождённых крыс на 42–180-е сутки постнатального периода онтогенеза с учётом пола и степени недоношенности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное, одноцентровое, проспективное, выборочное, контролируемое, нерандомизированное исследование.

В эксперименте участвовали преждевременно рождённые и доношенные самцы и самки крыс линии Вистар. Все животные, использованные в эксперименте, получены от интактных самцов (2 мес, масса тела — 180±20 г) и самок (3 мес, масса тела — 180±20 г) крыс линии Вистар. Самца подсаживали к самке, находящейся в стадии проэструса, на ночь, после чего для верификации коитуса проводили анализ влагалищного мазка. При обнаружении в мазке сперматозоидов считали этот день первым днём беременности. Для получения недоношенного потомства преждевременные роды индуцировали подкожным введением 1 мл мифепристона (Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Поскольку инъекция мифепристона приводит к началу родов у крыс через 18–24 ч [6], для индукции родов на 21,5-е сутки и 21-е сутки мифепристон вводили на 20,5-е и 20-е сутки беременности соответственно.

Всего в исследовании использованы 72 крысы, которых разделили на группы по 24 особи в каждой (12 самцов и 12 самок, по 4 животных каждого пола на каждый экспериментальный срок): контрольную группу составили доношенные крысы, продолжительность внутриутробного периода которых — 22 сут; 1-я группа сформирована преждевременно рождёнными животными с продолжительностью внутриутробного периода 21,5 сут (недоношенность на 12 ч); 2-я группа — преждевременно рождёнными животными с продолжительностью внутриутробного периода 21 сут (недоношенность на 24 ч). Массу крыс на момент рождения измеряли на лабораторных весах HL-100 (A&D, Япония).

Все крысы содержались в стандартных условиях вивария. Животных выводили из эксперимента асфиксией СО₂ на 42, 56 и 180-е сутки постнатального периода онтогенеза.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование

Сердце крыс фиксировали в течение 24 ч в 10% формалине (pH=7,4) для последующей заливки в парафиновые блоки. На автоматическом микротоме HM 355S (Thermo Fisher Scientific, Китай) получали поперечные срезы сердца (толщина — 5 мкм) на уровне сосочковых мышц. Срезы окрашивали гематоксилином Джилла («БиоВитрум», Россия) и эозином («БиоВитрум», Россия), а также использовали для иммуногистохимического выявления активированной каспазы-3 (маркёра апоптоза). В качестве первичных антител применяли #9961 Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody (Cell Signaling Technology, США). Постановку и визуализацию иммуногистохимической реакции проводили с использованием набора Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit (Abcam, Великобритания). В каждой серии иммуногистохимического окрашивания осуществляли постановку положительного и отрицательного контроля.

Гистологические и иммуногистохимические препараты сердца изучали при помощи светового микроскопа Axioscope 40 (Zeiss, Германия). На фотографиях препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в программе ImageJ 1.48 (NIH, США) измеряли толщину боковой стенки левого желудочка (3 измерения для каждого животного), диаметр кардиомиоцитов (в 20 клетках у каждого животного), а также определяли удельный объём кардиомиоцитов методом точечного счёта (5 измерений для каждого животного). На иммуногистохимических препаратах подсчитывали количество каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов в 1 мм² миокарда левого желудочка крыс (5 измерений для каждого животного).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывали.

Статистическую обработку морфометрических данных выполняли в программе SPSS17.0. Проверку распределения количественных параметров на нормальность осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Поскольку выборки не соответствовали нормальному закону распределения, для установления различий между группами применяли однофакторный дисперсионный анализ (критерий Краскела–Уоллиса). При выявлении в ходе такого анализа межгрупповых различий проводили попарное сравнение с помощью критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены в виде медианы и квартилей — Мe [Q1; Q3], достигнутый уровень значимости обозначен как р. Различия считали статистически значимыми при р <0,01.

Этическая экспертиза

Исследование выполнено при соблюдении Федерального закона N 498-ФЗ «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» от 27.12.2018 г. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (№ 8475/1 от 30.11.2020).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для оценки полоспецифичных эффектов преждевременного рождения на строение сердца исследование проведено на крысах обоего пола в период полового созревания и половой зрелости. Для оценки влияния степени недоношенности на строение сердца выделены две группы преждевременно рождённых животных с различной продолжительностью внутриутробного периода развития.

Индукция преждевременных родов мифепристоном является общепризнанной моделью недоношенности в случае использования грызунов в качестве лабораторных животных [6]. В настоящем исследовании введение мифепристона приводило к преждевременным родам крыс во всех случаях.

На протяжении эксперимента не зафиксировано гибели недоношенных на 12 ч крыс. Среди недоношенных на 24 ч крыс отмечена гибель 1–2 животных из помёта в ходе первых суток постнатального периода онтогенеза. Следует отметить, что индукция родов у крыс на 36 ч ранее срока приводит к появлению нежизнеспособного потомства: гибель наступает в первые минуты после рождения животных.

Масса самцов и самок крыс контрольной группы на момент рождения составила 6,0 [5, 7; 6, 2] и 5,7 [5, 5; 5, 9] г соответственно. Масса тела новорождённых крыс 1-й группы оказалась ниже, чем контрольных, и составила для самцов 5,6 [5, 4; 5, 8] г, р=0,004, для самок — 5,0 [4, 8; 5, 3] г, р=0,000. Масса тела самцов и самок крыс 2-й группы на момент рождения составила 4,3 [4, 1; 4, 6] и 4,0 [3, 6; 4, 3] г соответственно, что статистически значимо ниже аналогичных показателей животных контрольной и 1-й групп (р=0,000 во всех случаях).

Стенка левого желудочка сердца преждевременно рождённых и доношенных животных на 42–180-е сутки постнатального периода онтогенеза имеет принципиально схожее строение (рис. 1, a–c). Миокард образован двуядерными кардиомиоцитами, окружёнными обильно васкуляризованным интерстицием. Обращает на себя внимание гиперемия кровеносных капилляров миокарда самцов и самок крыс всех групп. Толщина стенки левого желудочка, а также диаметр сократительных кардиомиоцитов самцов и самок крыс контрольной, 1-й и 2-й групп увеличивается в ходе постнатального периода онтогенеза. Преждевременное рождение не приводит к увеличению данных показателей в сердце самцов и самок крыс с 42-х по 180-е сутки постнатального периода онтогенеза (табл. 1). В настоящем исследовании измерение толщины боковой стенки левого желудочка проводилось на гистологических препаратах, а не на нативных или фиксированных сердцах крыс. Некоторые процедуры пробоподготовки, в частности дегидратация, приводят к сжатию образца, что служит причиной систематической погрешности измерения исследуемого показателя. Это необходимо учитывать при сравнении полученных в данной работе абсолютных значений толщины боковой стенки левого желудочка с результатами других научных исследований.

 

Рис. 1. Миокард левого желудочка самцов крыс контрольной, 1-й и 2-й групп, 180-е сутки постнатального периода онтогенеза; окраска гематоксилином и эозином, ×400 (a–c); иммуногистохимическое выявление активированной каспазы-3, докраска гематоксилином Джилла; ×630 (d–f). Стрелка указывает на иммунопозитивные кардиомиоциты. Бар — 50 мкм.

 

Таблица 1. Динамика морфометрических параметров левого желудочка сердца преждевременно рождённых крыс, Мe [Q1; Q3]

Table 1. Dynamics of heart left ventricle morphometric parameters of preterm born rats (Мe [Q1; Q3])

Группа	Сутки постнатального периода онтогенеза
	42-е		56-е		180-е
Пол	самцы	самки	самцы	самки	самцы	самки
Толщина стенки левого желудочка, мкм
Контрольная	1159,0 [1054, 2; 1230, 7]	1200,5 [1127, 7; 1261, 8]	1650,0 [1470, 5; 1765, 0] р=0,000*	1399,1 [1333, 6; 1474, 7] р=0,000* р=0,008**	1966,9 [1944, 1; 2086, 5] р=0,000*	1952,5 [1881, 3; 2019, 0] р=0,000*
1-я	1201,1 [1077, 9; 1301, 1]	1136,0 [1050, 1; 1241, 8]	1508,0 [1419, 2; 1639, 5] р=0,000*	1437,9 [1325, 0; 1505, 9] р=0,000*	1994,0 [1878, 7; 2091, 5] р=0,000*	1920,7 [1713, 0; 1980, 4] р=0,000*
2-я	1127,9 [1047, 9; 1159, 0]	1162,2 [1106, 0; 1216, 0]	1510,7 [1378, 2; 1704, 7] р=0,000*	1378,5 [1304, 5; 1441, 6] р=0,000* р=0,002**	2007,1 [1975, 5; 1095, 9] р=0,000*	1994,2 [1981, 3; 2041, 1] р=0,000*
Диаметр кардиомиоцитов, мкм
Контрольная	10,6 [9, 6; 11, 2]	10,9 [10, 2; 12, 1]	11,5 [10, 4; 12, 5] р=0,000*	12,0 [11, 0; 12, 9] р=0,001*	12,3 [11, 8; 13, 7] р=0,000*	12,2 [11, 1; 13, 8]
1-я	10,8 [9, 8; 12, 4]	10,9 [10, 2; 11, 6]	11,3 [10, 3; 12, 7]	12,1 [10, 8; 13, 0] р=0,001*	12,4 [11, 9; 13, 9] р=0,000*	12,4 [11, 5; 13, 7] р=0,009*
2-я	10,9 [9, 9; 12, 4]	11,4 [10, 4; 12, 2]	11,9 [10, 8; 13, 3] р=0,001*	12,1 [11, 3; 12, 8] р=0,000*	12,9 [11, 8; 13, 6] р=0,002*	12,3 [11, 7; 13, 7]
Удельный объём кардиомиоцитов, усл. ед.
Контрольная	65,5 [64, 0; 68, 5]	66,0 [65, 0; 67, 0]	64,0 [63, 0; 65, 0]	63,0 [62, 0; 65, 0] р=0,001*	63,5 [62, 0; 65, 8]	63,0 [61, 2; 65, 0]
1-я	55,5 [53, 0; 59, 5] р=0,000†	54,0 [53, 0; 57, 0] р=0,000†	56,5 [53, 0; 58, 0] р=0,000†	55,0 [54, 2; 57, 0] р=0,000†	55,5 [55, 0; 56, 7] р=0,000†	56,0 [55, 0; 57, 0] р=0,000†
2-я	59,0 [57, 0; 59, 0] р=0,000†	58,0 [56, 2; 59, 0] р=0,000† р=0,001††	59,0 [57, 0; 60, 0] р=0,000† р=0,006††	58,0 [56, 2; 60, 0] р=0,000† р=0,007††	57,5 [55, 0; 59, 0] р=0,000†	58,5 [56, 2; 59, 0] р=0,000† р=0,001††
Количество каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов в 1 мм2, шт.
Контрольная	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]
1-я	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]	0 [0; 0]
2-я	0 [0; 0]	0 [0; 0]	6,3 [0; 12, 5] р=0,009* р=0,005† р=0,005††	0 [0; 0]	3,1 [0; 6, 3]	0 [0; 6, 3]

Примечание: * отличие от показателя животных этой же группы на предыдущий срок; ** отличие от показателя самцов крыс этой же группы; ^† отличие от показателя крыс контрольной группы; ^†† отличие от показателя крыс 1-й группы; р — уровень значимости.

Note: * difference from the indicator of animals of the same group for the previous period; ** difference from the indicator for male rats of the same group; ^† difference from the indicator of rats in the control group; ^†† difference from the indicator of rats of the 1st group; p — significance level.

 

Удельный объём кардиомиоцитов левого желудочка животных всех групп с 42-х по 180-е сутки постнатального периода онтогенеза является стабильным показателем. Снижение данного показателя на 56-е сутки по сравнению с аналогичным показателем на 42-е сутки постнатального периода онтогенеза наблюдается только у самок крыс контрольной группы. Преждевременное рождение независимо от пола приводит к снижению удельного объёма кардиомиоцитов левого желудочка с 42-х по 180-е сутки постнатального периода онтогенеза. Более выраженное снижение удельного объёма кардиомиоцитов левого желудочка наблюдается у животных 1-й группы (см. табл. 1).

Для оценки интенсивности апоптоза в миокарде левого желудочка преждевременно рождённых животных проведено иммуногистохимическое выявление активированной каспазы-3. У самцов и самок крыс контрольной и 1-й групп в левом желудочке единичные каспаза-3-позитивные кардиомиоциты обнаруживаются на 180-е сутки постнатального периода онтогенеза (рис. 1, d–f). Однако при большей степени недоношенности у самцов и самок крыс 2-й группы каспаза-3-позитивные кардиомиоциты определяются в левом желудочке начиная с 56-х суток постнатального периода онтогенеза. Статистически значимое увеличение числа каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов показано исключительно в левом желудочке самцов крыс 2-й группы (см. табл. 1). В иммунопозитивных кардиомиоцитах в сердце крыс всех групп продемонстрирована характерная саркоплазматическая локализация активированной каспазы-3 (см. рис. 1, d–f).

ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдаемое в ходе эксперимента у крыс всех групп увеличение толщины стенки левого желудочка и диаметра кардиомиоцитов в ней является следствием роста животных и повышения гемодинамических нагрузок. У преждевременно рождённых крыс нами, в отличие от A. J. Lewandowski с соавт. [7] и M. Bertagnolli с соавт. [8], не обнаружено признаков гипертрофии левого желудочка, таких как увеличение толщины его стенки и диаметра кардиомиоцитов. Преждевременное рождение крыс независимо от пола и степени недоношенности не приводит к развитию гипертрофии левого желудочка сердца на 42–180-е сутки постнатального периода онтогенеза.

Снижение удельного объёма кардиомиоцитов, наблюдаемое в левом желудочке у преждевременно рождённых животных, в первую очередь связано с развитием интерстициального фиброза [8] как ответной реакции на повышенные гемодинамические нагрузки [9], однако отчасти может быть обусловлено интенсификацией апоптоза кардиомиоцитов. Известно, что невысокий, но стабильный уровень апоптоза кардиомиоцитов может обусловливать функциональную недостаточность сердца [10]. Примечательно, что меньшая степень недоношенности не приводит к увеличению количества каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов как у самцов, так и у самок крыс на 42–180-е сутки постнатального периода онтогенеза. При большей степени недоношенности у самцов, но не у самок крыс, наблюдается увеличение количества каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов на 56-е сутки постнатального периода онтогенеза.

Возможной причиной увеличения числа каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов у преждевременно рождённых крыс являются продемонстрированные нами ранее трофические нарушения в левом желудочке [11]. Снижение у крыс удельного объёма кровеносных капилляров и трофического индекса миокарда на 56-е и 180-е сутки постнатального периода онтогенеза также наблюдалось исключительно при большей степени недоношенности [11]. Гиперемия сосудов микроциркуляторного русла отмечена в сердце как доношенных, так и преждевременно рождённых животных и является, вероятно, следствием использования СО₂ для их умерщвления.

Ограничения исследования

Проведённая работа не даёт представления об интенсивности других форм клеточной гибели кардиомиоцитов (некроз, аутофагическая гибель и др.) преждевременно рождённых животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У половозрелых самцов и самок крыс разной степени недоношенности структурная организация стенки сердца аналогична таковой у доношенных животных. Диаметр кардиомиоцитов и толщина стенки левого желудочка преждевременно рождённых крыс не отличаются от показателей доношенных животных. Продемонстрированы эффекты преждевременного рождения на удельный объём кардиомиоцитов и количество каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов левого желудочка, однако влияние пола и степени недоношенности на эти параметры неоднозначно. Более раннее увеличение количества каспаза-3-позитивных кардиомиоцитов в левом желудочке крыс, рождённых на 24 ч ранее срока, свидетельствует о различном компенсаторно-адаптационном потенциале миокарда животных при разной степени недоношенности. Результаты исследования позволяют предположить кардиопротективное влияние женских половых стероидов у преждевременно рождённых животных.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (проект № 24-25-00015).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: В. В. Иванова — проведение эксперимента, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; О. Н. Серебрякова — иммуногистохимическое исследование; А. В. Ерохина — морфометрический и статистический анализ данных; А. Д. Никонова — гистологическое исследование; И. В. Мильто — проведение эксперимента, редактирование статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was supported by the Russian Science Foundation (project No. 24-25-00015).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. V. V. Ivanovа — experimental procedures, collection and analysis of literary sources, writing the text and editing the article; O. N. Serebryakova — imunohistochemical examination; A. V. Erokhina — morphometric and statistical data analysis; A. D. Nikonova — histological examination; I. V. Milto — experimental procedures, editing the article.

About the authors

Vera V. Ivanova

Siberian State Medical University

Author for correspondence.
Email: ivvera92@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-2530-1112
SPIN-code: 9476-3329

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Tomsk

Оlga N. Serebryakova

Siberian State Medical University

Email: oserebryakovan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2924-0724
SPIN-code: 3572-7818
Russian Federation, Tomsk

Alexandra V. Erokhina

Siberian State Medical University

Email: shura.erokhina.23@gmail.com
ORCID iD: 0009-0006-3109-1349
SPIN-code: 4424-1500
Russian Federation, Tomsk

Anastasia D. Nikonova

Siberian State Medical University

Email: nastya71103@gmail.com
ORCID iD: 0009-0007-7297-5033
SPIN-code: 3514-7576
Russian Federation, Tomsk

Ivan V. Milto

Siberian State Medical University; Seversk Biophysical Research Centre

Email: milto_bio@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9764-4392
SPIN-code: 4919-2033

Dr. Sci. (Biology), Assistant Professor

Russian Federation, Tomsk; Tomsk

References

Supplementary files